Métodos de criopreservación de células Stem mesenquimales en dientes temporales y permanentes humanos.

1. Dr. Juan Carlos Munévar N. Od, MSc, D.E.A. Biólogo Oral
Bioética, Docencia Universitaria. Profesor Asociado.
Instituto Unidad de Investigación Básica Oral. U.I.B.O.
UNIVERSIDAD EL BOSQUE.

2. FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
REGENERACIÓN TISULAR &
CELULAS STEM DENTALES / CRANEOFACIALES
Evaluación de dos métodos de criopreservación
de células Stem mesenquimales en dientes
temporales y permanentes humanos.
Munévar J.C. Romero Oyuela S, Córdoba Pérez K, Lafaurie G, Perdomo S.
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
Bogotá, Septiembre 2012

3. Interés en las células Stem debido a su
enorme potencial terapéutico in vivo

5. Terapias basadas en Células Stem
Requisitos
• Financiación gubernamental y privada
• Regulación apropiada
• Ensayos clínicos.
• Nuevas tecnologías
• Modelos in vitro de enfermedades
• Criopreservación

7. Células Stem Grado clínico
Embrionarias
Adultas
Hematopoyéticas Mesenquimales
 PDLSCs Seo y col 2004
 DPSCs Gronthos y col 2000
 SHEDs Miura y col 2003
 SCAPs Sonoyama 2008
 iPS Yamanaka S, 2009
 DFPSC Morzseck y col 2005
Propiedades
Hiroshi Egusa y col/2012. Stem cells in dentistry – Part I: Stem cell sources.
• Auto renovación in vitro / in vivo Journal of Prosthodontic Research 56 (2012) 151–165
• Adherentes in vitro
• Potencial de diferenciación in vivo
• Reserva celular in vivo
Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow IA: Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the
in vitro colony assay method. Exp Hematol 1974, 2:83-92

8. Ikeda E y col/2009. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ
replacement therapy. PNAS.
Graysson W y col/2010. Engineering anatomically shaped human bone grafts. PNAS
Desarrollar óptimos
métodos de cultivo
, expansión y
criopreservación de
DSCs en Colombia
Kim K y col. Anatomically Shaped Tooth and Periodontal Regeneration by Cell Homing. J Dent Res 89(8):842-847, 2010

9. Optimizar la seguridad y el control de calidad de los métodos empleados
in vitro con las células Stem para aplicaciones terapéuticas in vivo.
CRIOPRESERVACION
La criopreservación es el proceso de congelamiento de las células con
el fin de reducir su actividad metabólica y mantenerlas a temperaturas
reducidas durante tiempos prolongados, preservando al mismo tiempo
su VIABILIDAD, FENOTIPO Y POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN.
Woods EJ, Benson JD, Agca Y, Critser JK. Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. 2004. Cryobiology; 48:146-56.V
Brandon Perry, Dan Zhou, Xiaohua Wu. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derivded
mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering: Part C. Volume 14, Number 2, 2008.

10. Evaluar el efecto de dos métodos de criopreservación
sobre la viabilidad y el fenotipo de células STEM
mesenquimales en dientes temporales y permanentes
humanos.

11. Expansión
Pacientes
Estudio Experimental in vitro in vitro
Consentimiento informado
Comité Institucional de Ética en 7-12 años y 14-30 Células
Investigación años CD105+
Premolares y molares
erupcionados e incluidos y
dientes temporales en
exfoliación
Sin tratamiento
farmacológico
Sistémicamente sanos

13. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Procedimientos realizados
en la Clínica el Bosque
Luego de la exodoncia se
sumergió el diente en
NaOCl 5%
Sección del diente a nivel
UAC irrigando con solución
salina

14. 1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL
DMEM suplementado SFB 10% Mecánica Enzimática
3. VIABILIDAD CELULAR 4. SEPARACIÓN MAGNETICA
Cámara de Neubauer Células CD105+
MILTENYI MiniMACS
Romero Oyuela S, Cordoba Perez K/2011. Unidad de Investigación Básica Oral. UIBO.

15. Papaccio et
5. Expansión in vitro CD105+ al/2006
NH Stem cell Incubación 6. CRIOPRESERVACIÓN
37°C, Atmósfera
medium
húmeda 5% de CO2, Kamath et al/2007
MILTENYI 70% confluencia
Biotec celular
Fischer Scientific
7. DESCONGELACIÓN
8. CITOMETRIA DE
FLUJO
9. ANALISIS ESTADISTICO
Test T Student U Mann Whitney
P≤0.05
Control - Control +
fibroblastos C.U.H.
Romero Oyuela S, Cordoba Perez K/2011. Unidad de Investigación Básica Oral. UIBO.

16. PROTOCOLOS DE CRIOPRESERVACIÓN
Método de Kamath, A.
Método de Papaccio y col/2006 (SC Protocol Sheet: 00007 Thermo Fisher Scientific.
Cellular engineering technologies, Inc.)
Desprenden las DPSCs de la monocapa con EDTA 0.02% Retiro de monocapa se lava con PBS 10ml/75cm2
en PBS
Conteo celular en hemocitometro Se agrega 5 ml de solución de Tripsina 0,5%
(SH30042.01) Thermo Scientific HyClone
Se deposita la suspensión celular en solución de Incubación enzimática a 37ºC por 5 minutos
criopreservacion DMSO 10% en SFB
Se deposita la suspensión celular en un criovial 4ºC Se agrega 5ml NH CFU-F y se centrifuga a 200rpm por 10
durante 2hrs, luego a -70ºC por 16 hrs, minutos
Finalmente -196ºC en nitrógeno líquido hasta el proceso Conteo celular en hemocitometro
de descongelación
Se deposita la suspensión celular en solución de
criopreservación DMSO 10%, SFB 70% y 20% NH CFU-F
en nitrógeno líquido -196oC

17. PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN
Retiro de criovial DPSCs que
se encontraba a
Se deposita el criovial
-196ºC en tanques de
al baño maría bajo
nitrógeno liquido agitación moderada
Se agregará 10 ml de solución Bajo la cabina de flujo laminar
de descongelamiento se abrirá cada criovial para
precalentada a la suspensión transferir el contenido en tubos
celular obtenida. Falcon de 15 ml
La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino y 20% de NH Expansion Medium. Se
centrifuga a 200 g durante 10 minutos la suspensión celular obtenida.
Se retira el sobrenadante para resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo NH Expansion Medium y así realizar
la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad y fenotipo de las DSCs mediante citometría de flujo.

18. CITOMETRÍA DE FLUJO
EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN
Evaluación de la viabilidad mediante
exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D)
Fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la
suspensión de células DPSCs sometidas a 2
procesos distintos de criopreservación en 3
tiempos diferentes.
(FACS CANTO II Becton & Dickinson)
Marcaje leído en el citómetro de flujo en U.I.B.O. reportando cada dato
como porcentaje para cada marcador en cada condición.

19. Morfología in vitro de células Stem
MSC de Cordón Umbilical in de pulpa dental. 40x
vitro. 10x
Unidades Formadora de
Morfología in vitro de Colonias (DPSCs). 10x
fibroblastos de la pulpa
dental humana.
10 x

20. Morfología in vitro de células Stem
MSC de Cordón Umbilical in de pulpa dental. 10x
vitro. 10x
Morfología in vitro de
fibroblastos de la pulpa Unidades Formadora de
dental humana. Colonias (DPSCs). 40x
10 x

21. 63.3%
59.1%
61.2%
Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación
Evaluación Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación

22. Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo

23. 92,03% 99,75% 99,56%
98,39% 96,84%
Fenotipo De Células SHEDs Por Citometría De Flujo método de Papaccio.

24. Estudios recientes describen métodos de caracterización, aislamiento
y cultivo celular de DPSCs, pero no analizan factores relevantes sobre
la efectividad de la criopreservación. Chen YK y col/2011; Umemura E y
col/2011; Ding G y col/2010; Temmerman L y col/2010
Tiempo de almacenamiento de la muestra.
Perry y col/2008 Nuestro estudio
Muestra 24h a 4 C DMEM Muestra +/- 1h DMEM
Tiempo de almacenamiento post-extracción no es un
limitante para que se de un cultivo exitoso
Woods E, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental pulp-
derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157.

25. La Disgregación enzimática
Disgregación afectaría los resultados:
mecánica / enzimática,
procedimiento previo Compromiso de la integridad
a la criopreservación de las proteínas de las
semejante al empleado membranas celulares.
por Perry et al/2008.
Woods y col/2009
Seo et La disociación enzimática
al/2005, criopreservación genera estrés en las
realizada directamente membranas predisponiendo
sin antes disgregar el a crio lesiones leves.
tejido.
3 mg/mL Colagenasa & 4 mg/mL Dispasa.
Seo BM., Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S, et al. Recovery of Stem Cells from Cryopreserved Periodontal Ligament.
J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912..

26. Cultivo celular
En nuestro estudio DPSCs en microscopia de
contraste de fase se observaron birrefringentes,
presentaron una morfología fibroblast-like con
prolongaciones citoplasmáticas, 1/3 relación
núcleo/citoplasma
Previos estudios han descrito la morfología
fibroblast-like para las DPSCs
Gronthos et al/2000; Shen-Yang Lee et al/2010
En algunos pozos se observó la formación de
Unidades Formadoras de Colonias (CFU-F)
Polisetty et al/2008, DPSCs in vitro forman CFU-F
que disminuyen con los números de pasajes.
Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis. 2008; 14: 431-442.

27. Viabilidad y fenotipo
Temmerman et al/2010
Nuestro estudio
• Evalúa la viabilidad in vitro del
tejido pulpar de terceros
molares inmaduros de acuerdo
• CITOMETRIA DE FLUJO al porcentaje de confluencia
• Viabilidad exclusión 7-AAD alcanzado en el primer pasaje
• Fenotipo • No evalúan el fenotipo
CD105+/CD73+/CD34-/CD45- celular con sus respectivos
•2 métodos de marcadores.
criopreservación.
La criopreservación podría modificar la configuración espacial de la proteína
de membrana celular comprometiendo su detección por citometría de flujo o
bien quizás afecta su estadio de diferenciación celular.

28. El método de criopreservación podría alterar la viabilidad y la expresión de los
marcadores que caracterizan el fenotipo Stem Mesenquimal
El método de criopreservación de Papaccio es mas apropiado para preservar la
viabilidad y fenotipo de las DSC humanas.
Para diseñar estudios clínicos y terapias basadas en células DSC que tengan
impacto en Colombia es necesario desarrollar métodos apropiados para
criopreservar células Stem grado clínico
Establecer alianzas estratégicas / redes de conocimiento nacionales y con
instituciones extranjeras para ejecutar proyectos de investigación con células
DSC con aplicación en la clínica medica y odontológica (Medicina Traslacional)
Continuar con la línea de investigación y evaluar in vivo el potencial de
regeneración después de la criopreservación.

29. En algún momento nuestros parientes o quizás nosotros
mismos sufriremos una patología para la cual sería necesario
un tratamiento basado en células stem y por eso la
investigación en células stem es fundamental
Estandarizar tiempo de manipulación, reactivos humanos
para procesamiento (libres de proteína animal:
mTESR), sistemas de criopreservación automatizados y
calibrados
Obtener DSCs grado clínico: Buenas prácticas de
manufactura & Buenas Prácticas Clínicas (Inversión
Financiera, legislación vigente)
Difundir nuevo conocimiento para abrir la puerta hacia el
desarrollo de Tratamientos con células stem que permitan
trasladarlos a escenarios in vivo.