El documento describe los mecanismos moleculares de la apoptosis o muerte celular programada. Existen dos vías principales de apoptosis: la vía extrínseca mediada por receptores de muerte y la vía intrínseca mediada por la mitocondria. Esta última involucra a la familia de proteínas Bcl-2, las cuales controlan la liberación del citocromo c de la mitocondria y la activación subsecuente de la cascada de caspasas, llevando a la apoptosis.

1. Apoptosis celular

2. Puntos de Regulación Durante la interfase hay dos puntos de regulación esenciales: uno durante G1 , antes de la entrada a la fase S y el otro en G2 , previo al inicio de la fase M . En la etapa de división se encuentra el punto M Ciclo Celular-UAM-I ALTO ALTO ALTO

3. Apoptosis, muerte celular programada Funciones Biologicas de la apoptosis  En el desarrollo, homeostasis, vigilancia a tumores, y función de sistema inmune.

5. Características morfológicas y bioquímicas de la apoptosis  Cambios morfológicos : Tempranos : Condenzación de cromosomas, “encogimiento celular” Tardios: Blebbing y fragmentación del nucleo citoplasma cuerpos Apoptoticos Posteriormente: son fagocitados

6. A 、 Normal cell B 、 Apoptosis: Apoptotic bodies

7. Cytological characteristics of Apoptosis Nucleus condensation. Membranes preserved. Fragmentation. phagocytosis

8.  Características bioquímicas apoptosis Apoptosis inducida por Cyto C Lane 1 ． 0 h 2 ． 1 h 3 ． 2 h 4 ． 3 h 5 ． 4 h 6 ． Control 7 ． Marker 2.0kbp 1.0 0.5 0.2 DNA ladder: 180~200bp Acumulación de tTG , PS flip-flop

9. Contrast ofApoptosis and necrosis Apoptosis Necrosis Death by apoptosis is a neat, orderly process

10. 3.Mecanismos moleculares de apoptosis Primeras investigaciones (MIT: Robert Horrid , 1986) C. elegans :1090 cels, Hallazgos de mutantes de CED3 No hay pérdida de cualquiera de sus cels por apoptosis. El gen CED3 juega roll crucial en el proceso de apoptosis. C elegans : a millimeter long, transparent body only a few cell types, from zygote to mature adult only in 3.5days. 131 cels mueren

11. La apoptosis es desarrollada por un sistema proteolítico — caspases (1) Porqué se llaman caspasas? Active site : Cysteine Cleavage site : Asparatic acid C ysteine Asp artic acid specific prote ase Aps-Xxx

12. Apoptosis se divide en dos fases ：  Fase de activación ： La célula responde a “señal de muerte” que induce al inicio de la autodestrucción.  Fase de ejecución ： Se ejecuta la orden de muerte. Las células apoptoticas son reconocidas por fagocitos porque tienen marcadores (señales a comer). Presencia – translocación de fosfatidilserina a la parte externa de la membrana celular, llama a los PMN (by flop-flipase).

13. Como se activan las caspasas Todas las caspasas se expresan como proenzimas - Procaspasas Procaspasa NH2-terminal prodomain : Highly variable Large subunit (20kD) Small subunit (10kD) Como se activan para iniciar la cascada de caspasas? La activación es gatillada por proteínas adaptadoras que unen multiples copias de procaspasas específicas. 3 grupos de caspasas: 1 、 iniciadoras de apoptosis: caspase-2, caspase-8, caspase-9 and caspase-10 2 、 ejecutoras de apoptosis: caspase-3, caspase-6 ， caspase-7 and 14 (morphology change) 3 、 Mediadores inflamatorias : caspase-1, and caspase-11

14. Procaspasas: activadas por unión de proteínas adaptadoras Cascada de caspasas implicadas en apoptosis Activación de procaspasa por corte proteolítico Cascada de caspasas

15. Proteínas blanco de caspasas:  Más de una docena de proteínas kinasa , FAK, PKC, Raf1. FAK– rompe la adhesión celular en células apoptóticas  Laminas . El corte de láminas lleva al desensamble de la lámina nuclear y shrinkage (encogimiento) del núcleo.  Proteínas requeridas para la estructura celular . Actina, gelosolina. Corte e inactivación de estas lleva a cambio de forma celular.

16. Vías moleculares de apoptosis Dos principales vías Extrinsica Intrinsica

17. (1) Via extrinsica: Fas Signaling Fas (también llamada Apo-1 o CD95) receptor de la superfamilia del factor de necrosis tumoral ( TNFR). Apoptosis mediada por Receptor Bcl-2 Familia (factores citoplasmicos) : Bad,Bid y bax: promotores de apoptosis; Bcl-X, Bcl-w y Bcl-2: previenen apoptosis. Estímulos internos: Daño al DNA, Ca 2+ alto, estrés oxidativo.

19. External signals: Death receptor pathway

20. (2) Vía intrinseca: Mitocondrial pathway Apoptosis mediada por mitochondria Varous tipos de estrés celular La familia Bcl-2: Bad o Bax se insertan en OM de Mitocondría Liberación de citocrome C desde el espacio I-O de la mitocondria Se forma el complejo de multi-subunidades: cascada de Caspasas .…

21. Se requiere la activación de Caspasa -2 para permeabiulizar de la mitocondria, liberación de cytochrome C, y apoptosis

22. Internal signals: Mitochondrial pathway

23. Vías de muerte celular mamíferos

24. Apoptosis (Program cell death) Factors that induce apoptosis: Internal stimuli: abnormalities in DNA External stimuli: removal of growth factors,addition of cytokines (Tumor Necrosis Factor or TNF) Signal transduction pathways leading to apoptosis: There are two major pathways: intrinsic pathway ( mitochondria-dependent) and extrinsic pathway ( mitochondria-independent) . • •

25. Mitochondria The outer membrane and intermembrane space are involved in apoptosis signaling

26. Internal (Mitochondrial) Pathway

27. The bcl-2 family of proteins BH: bcl-2 homology 6 proteins 18 proteins

28. The bcl-2 family proteins homo- and hetero-dimerize The Bcl-2 family members can form homo- or hetero-dimers through the BH3 domains. The pro-apoptotic Bax homo-dimers promotes apoptosis. Bcl-2 forms hetero-dimers with Bax, leading to the inhibition of the apoptotic activity of Bax. How do these proteins regulate apoptosis? • • • Thus, the relative levels of pro-survival and pro-apoptosis Bcl-2 family proteins determine cell survival or apoptosis.

29. Bcl-2 family proteins control cytochrome c translocation Bax forms homo-dimers in the presence of apoptotic signals. This homodimer presumably promotes the opening of a channel that controls the translocation of cytochrome c from the intermembrane space to cytoplasm • Bcl-2 interferes with Bax function by forming a hetero dimer with Bax. This leads to the closing of the channel and inhibition of cytochrome c translocation • intermembrane space cytoplasm

30. Cytochrome c translocation initiates caspase cascade In the cytosol, cytochrome c binds to Apaf-1 to form apoptosome • Apaf-1 Apoptosome Caspase 9 Procaspase 9 Procaspase 3 Caspase 3 Cyt. c The apoptosome recruits procaspase 9 to generate the active caspase 9 Caspase 9 then activates the executioner caspase 3, 6, 7 • •

31. Extrinsic and intrinsic pathways converge at executioner caspases Caspase 9 ligands Death receptors FADD/DISC Caspase 8, 10 Caspase 3, 6, 7 Lamin, CAD,actin, Adhesion molecules, etc Pro-apoptotic Bcl-2 proteins Cytochrome c translocation Apoptosome (Apaf-1/cyt.c) Intrinsic apoptosis signals

32. Caspase assay-- measure caspase activation TUNEL assay-- measure DNA fragmentation Activation of caspase 3 results in the cleavage of a synthetic caspase 3 substrate called DEVD-pNA (aspartate-glutamate-valine-aspartate p-nitroanalide). Cleavage of DEVD-pNA releases pNA, which can then be detected by a change it its absorbance at 405 nm. Apoptosis lab: Induction of apoptosis of Jurkat human T-cells by staurosporine.

33. Methods to measure apoptosis TUNEL assay: measure DNA fragmentation TdT ( t erminal deoxynucleotidyl transferase): adds dNTPs to the 3’ end of DNA molecules in the absence of a template Bright field FITC 3’ 5’ 3’ 5’ TdT FITC-dUTP