Este estudio evaluó los parámetros inmunológicos en perros tipo pitbull terrier con demodicosis generalizada de aparición juvenil y perros sanos de la misma edad. Los resultados mostraron que los perros con demodicosis tenían niveles más altos de las citoquinas IL-2 e IL-18 y la inmunoglobulina IgA. No hubo diferencias significativas en otros marcadores inmunológicos entre los grupos. Esto sugiere que las alteraciones en las citoquinas Th1 pueden estar involucradas en la patog

1. Evaluación de los parámetros inmunológicos en perros tipo pitbull terrier con demodicosis
generalizada de aparición juvenil y perros tipo pitbull terrier sanos de la misma edad

2. Demodecosis canina
• La demodecosis canina es una
afección cutánea frecuente
causada por la sobrepoblación
de ácaros Demodex en folículos
pilosos y glándulas sebáceas.
• Puede clasificarse clínicamente
como localizada o generalizada,
así como en formas de inicio
juvenil o adulto

3. • Enfermedad parasitaria de la piel
• Demodex canis considerado un habitante normal de
la piel del perro
• La transmisión ocurre por contacto directo de
madre-hijo
• El ciclo biológico sucede por completo sobre el
huésped
• Clinicamente existen tres formas diferentes;
localizada, generalizada y pododemodecosis
• Por qué algunos perros desarrollan la enfermedad y
otros no?
SARNA DEMODECTICA

4. DEMODECOSIS

5. DEMODECOSIS
DIAGNÓSTICO
• Raspados profundos
• Histopatologia
TRATAMIENTO
• La forma localizada no requiere tratamiento específico
• En la generalizada bañar con agentes antisepticos
• Especificamente baños con amitraz 1 vez por semana
durante 8 – 12 semanas
• Uso de antibióticos sistémicos
• Comunmente son usados agentes inmunomoduladores
• Ivermectina a dosis de 400 mcg/Kg ?

6. DEMODECOSIS
Demodex canis se considera un habitante normal de la piel canina y cuando se
presenta una enfermedad clínica, se cree que es la consecuencia de una
inmunodeficiencia específica mediada genéticamente que permite la
proliferación de los ácaros.

7. DEMODECOSIS
La evidencia sugiere que el sistema inmunitario del huésped es responsable del
control de la población de Demodex en la piel de los caninos; sin embargo, existe
una escasez de información con respecto al mecanismo de la respuesta inmune,
así como a la relación huésped-ácaro.

8. DEMODECOSIS
Se ha sugerido que la eficiencia del sistema inmunitario del huésped controla la
población de ácaros.
Sin embargo, otros autores proponen que la inmunosupresión cutánea ocurre
durante la enfermedad en lugar de preceder a los signos clínicos y puede ser una
consecuencia en lugar de un desencadenante primario para la sobrepoblación de
ácaros

9. DEMODECOSIS
Diferentes investigaciones sugieren que los perros con demodicosis generalizada
sufren de agotamiento de las células T, que generalmente se caracteriza por una baja
producción de citoquinas de apoyo / estimuladoras y altos niveles de citoquinas
supresoras

10. DEMODECOSIS
La demodicosis también se ha asociado con alelos de clase II del antígeno
leucocitario de perro (DLA) en boxer, mastines argentinos y perros de raza mixta.
Esto refleja los hallazgos en humanos que demuestran que los alelos de clase I del
antígeno leucocitario humano específico (HLA) conducen a la protección o
susceptibilidad al crecimiento excesivo de los ácaros

11. Objetivo
El objetivo de este estudio de investigación fue identificar las diferencias
inmunológicas a través de citometría de flujo, ensayos moleculares y
serológicos, entre perros de tipo pitbull terrier pareados por edad, con y sin
demodicosis generalizada de inicio juvenil (JOGD).

12. Animales
La población de perros consistió en una muestra de conveniencia de 24 perros de
refugio, hasta los 14 meses de edad, de razas pitbull terrier. Pitbull terrier
americano, American Staffordshire terrier, bulldog americano, Staffordshire
bullterrier y cruces potenciales entre estas razas.

13. Animales
El estudio incluyó 12 perros con JOGD y 12 perros sanos de la misma
edad. El grupo de perros tipo pit bull terrier fue elegido en base a un estudio
de análisis multivariado que informó que algunas razas de perros tienen un
alto riesgo de diagnóstico de JOGD
La demodicosis generalizada se definió como la participación de una región
corporal completa o más de cinco áreas focales o al menos dos patas
afectadas.

14. Animales
• La demodicosis se confirmó mediante la observación
de ácaros Demodex en raspados cutáneos
profundos, y la JOGD se definió como un diagnóstico
inicial de demodicosis generalizada hasta los 18
meses de edad.
• Un examen físico, recuento completo de células
sanguíneas, panel bioquímico sérico, flotación fecal
y sueros de detección del antígeno de Dirofilaria
immitis y anticuerpos contra Anaplasma spp. y
Ehrlichia spp. (Prueba SNAP 4DX Plus, Laboratorios
IDEXX: Westbrook, ME, USA).
• Los perros que resultaron positivos para otros
agentes infecciosos o con anormalidades
bioquímicas séricas que sugieren anormalidades
sistémicas fueron excluidos

15. CONTEO DE ACAROS
En el momento de la inscripción, el conteo de
ácaros se determinó mediante raspados
profundos en la piel de cuatro áreas afectadas
de perros tipo pitbull terrier en el JOGD grupo.
Los raspados se obtuvieron de un área cutánea
de 1 cm.
El material muestreado se extendió en un
portaobjetos de microscopio con la adición de
aceite mineral y se cubrió con un cubreobjetos.
Se registraron los números absolutos de cada
etapa de la vida (adultos, ninfas, larvas y
huevos) y si los ácaros estaban vivos o muertos.

16. La extensión de la lesión de la piel y la
puntuación de severidad.
• La puntuación clínica se basó en el Índice de gravedad y gravedad
de la dermatitis atópica canina
• Las lesiones cutáneas se clasificaron como eritema,
escamas/costras, comedones /pápula/Pústulas y alopecia.
• Se asignó una puntuación de gravedad (0 normal a 6
extremadamente grave) para cada tipo de lesión en cada región del
cuerpo.
• Para determinar la extensión de las lesiones cutáneas, el cuerpo se
dividió en nueve áreas diferentes, incluyendo el hocico / barbilla,
cara / área periocular, cabeza dorsal / pinna, área cervical, área
torácica, área abdominal, patas delanteras, patas traseras y cola /
perianal zona.

17. La extensión de la lesión de la piel y la
puntuación de severidad.
• El puntaje máximo total posible fue de 216.
•
• Se examinaron los frotis de impresión o las
preparaciones de cinta de acetato de dos áreas
afectadas diferentes de cada perro para detectar
pioderma secundario.
• Para los frotis de impresión, se presionó una
sección de un portaobjetos de microscopio sobre
la piel y se tiñó con Diff Quick, Todas las muestras
se examinaron bajo inmersión en aceite para
identificar bacterias.

18. Colección de muestra
• Se recogió sangre venosa (15 ml) de cada perro y se colocó en tubos que contenían EDTA.
•
• La sangre en EDTA se procesó inmediatamente como se describe para la citometría de flujo
• se enviaron 2 ml para un recuento completo de células sanguíneas (Veterinary Diagnostic
Laboratory, Colorado State University)
• Para ensayos de PCR cuantitativos (qPCR) para ARNm de citoquinas seleccionadas se
mezclaron 1,6 ml de sangre con 3,4 ml de "RNALater" (Thermo Fisher Scientific; Waltham,
MA, EE. UU.)
• La sangre coagulada se centrifugó 904 g durante 10 min a temperatura ambiente y luego se
extrajeron los sueros.
• La sangre en "RNALater" y los sueros se dividieron en alícuotas en tubos de plástico y se
almacenaron a -80°C hasta que se analizaron.

19. Colección de muestra
• Antes del almacenamiento, los sueros se les realizó un
panel bioquímico de suero Sueros almacenados se
descongelaron a temperatura ambiente y se evaluó:
IgA total, IgG total IgM total IgE total,IFN-gamma Y la
proteína C reactiva [CRP]
• Se usó para evaluar las citoquinas y quimiocinas
seleccionadas en los sueros almacenados que incluyen:
GM-CSF, quimioatrayente de queratinocitos (CXCL1),
proteína inducible por IFN-Y IL-2 , IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-
15, IL-18proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-
1) TNF-alfa.

20. qPCR
• La extracción de ARN se realizó utilizando un
kit comercial siguiendo las instrucciones del
fabricante
• Se utilizaron cebadores para las citocinas
caninas IL-13, IL-31, FoxP3 y el gen / enzima
fosforribosiltransferasa de hipoxantina (HPRT).
•
• PCR se realizó utilizando el sistema de
detección de PCR en tiempo real CFX96
TouchTM (Bio-Rad; Hercules, CA, EE. UU.) Y el
software CFX ManagerTM (Bio-Rad) para el
análisis de datos

21. Evaluación por citometría de flujo de la
activación de células linfoides y mieloides
• Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) usando centrifugación de
gradiente de densidad discontinua (Ficoll-
Plaque Plus, GE Healthcare).
• La sangre completa se diluyó 1: 2 con
solución salina tamponada con fosfato (PBS)
y se colocó lentamente sobre el gradiente de
densidad discontinua para evitar mezclar y
centrifugar a 400 g durante 30 min

22. Evaluación por citometría de flujo de la
activación de células linfoides y mieloides
• Las células se incubaron con suero de perro normal al 5% v/v en
tampón FACS durante 10 min a temperatura ambiente.
• Para el análisis de la activación de las células T, las células se
incubaron con anticuerpos directamente conjugados contra:
• -CD4 canina (clon YKIX302.9, conjugado con Azul Pacífico, AbD
Serotec)
• -CD8 canina (clon YCATE55.9, Alexa 647, AbD Serotec),
• -CD5 canina (clon YKIX322.3, PE, eBioscience; San Diego, CA, EE.
UU.)
• -MHC canino Clase II (clon YKIX334.2, FITC, eBioscience)
• -un control de isotipo IgG2a K de rata (clon 3BR2a, FITC,
eBioscience)

23. Evaluación por citometría de flujo de la
activación de células linfoides y mieloides
• Para el análisis de células B, se incubaron PBMC con anticuerpos
directamente conjugados contra:
• -CD21 canino (clon CA2.1D6, PE, AbD Serotec) para determinar el
tipo de célula,
• - MHC Clase II y anti-Dog IgG (IgG de conejo anti-Dog, Jackson
ImmunoResearch; West Grove, PA, EE. UU.)
• Las células se lavaron dos veces al finalizar la inmunotinción.y se fijó
en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos a temperatura
ambiente en la oscuridad.
• Se realizaron dos etapas de lavado antes de que las PBMC se
volvieran a suspender en tampón FACS y se transfirieran a tubos de
flujo para su análisis por citometría de flujo.

24. Evaluación estadística
• Se calcularon estadísticas descriptivas
• La prueba de Shapiro-Wilk se utilizó para evaluar la normalidad de
los datos.
• Debido a la falta de normalidad de las variables, la prueba de la
suma de rangos de Wilcoxon se usó para comparar los resultados
de la mediana de citoquinas, quimiocinas, inmunoglobulina,
linfocitos, monocitos y niveles de neutrófilos en el grupo JOGD en
comparación con el grupo sano
• Se utilizó el software disponible comercialmente (StataCorp 2015:
Versión 14, Stata Statistical Software; College Station, TX, EE. UU.)
Para todas las comparaciones. La significación se definió como P
<0.05.

25. RESULTADOS

26. Conteo de ácaros
A todos los perros de tipo pitbull terrier en el grupo de JOGD se les había
administrado un tratamiento con antibióticos durante al menos tres días antes de
ingresar al estudio. Sin embargo, todos los perros todavía tenían evidencia citológica
de pioderma secundario.

27. Citoquinas / Quimiocinas
Las concentraciones séricas de IL-2, IL-18 y MCP1 fueron significativamente más altas en el grupo
JOGD
Las concentraciones de IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF y KC no fueron
significativamente diferentes entre los perros sanos y los grupos JOGD
El kit disponible en el mercado no detectó IFN-gamma en los sueros almacenados de ningún perro.
Sin embargo, los niveles de IFNgamma se pudieron medir en sangre mediante un ensayo de PCR

28. Immunoglobulinas, FOXP3, CRP
Inmunoglobulinas, FOXP3, CRP El valor mediano de IgA fue significativamente mayor en
los perros tipo pitbull terrier de JOGD en comparación con los perros sanos tipo pitbull
terrier .
Las concentraciones de IgG, IgM, IgE, CRP y FOXP3 no fueron significativamente diferentes
entre los dos grupos de perros.

29. Citometría de flujo
La citometría de flujo reveló una expresión numéricamente mayor de IgG por parte de las
células B en perros tipo pit bull terrier con JOGD; sin embargo, los resultados no fueron
estadísticamente diferentes en comparación con los perros sanos.
Los monocitos, los neutrófilos y los marcadores de activación de las células T tampoco fueron
estadísticamente diferentes entre los dos grupos

30. Discusión
• Los niveles de IL-2 e IL-18 eran significativamente más altos en los
perros tipo pit bull terrier con JOGD que en los controles
emparejados por edad. Estas citoquinas se han considerado
importantes reguladores de la producción de citoquinas Th1 y Th2.
• Se han informado datos que muestran que los perros con
demodicosis tenían menos células que expresaban la mayor
afinidad CD25 del receptor de IL-2 y una menor producción de IL-2
en comparación con los perros de control o la expresión de IL-2
normal
• Los informes anteriores incluyeron perros de diferentes edades,
razas, presentación clínica (demodicosis localizada versus
generalizada), gravedad de la enfermedad y cronicidad de la
enfermedad, a diferencia de los perros en el estudio actual

31. Discusión
• La MCP-1 es una quimiocina que regula la migración e infiltración
de monocitos / macrófagos.
• La evidencia sugiere que MCP-1 es un mediador de citoquinas clave
en una variedad de enfermedades infecciosas e inflamatorias y
también puede ser útil para evaluar la gravedad de la enfermedad
en perros críticamente enfermos
• Las concentraciones séricas de MCP-1 aumentaron
significativamente en el grupo de perros tipo pit bull terrier de
JOGD en comparación con los valores observados en perros sanos
tipo pit bull terrier, posiblemente debido a la inflamación cutánea
presente en todos los perros

32. Discusión
• Se observó IgA en concentraciones más altas en
perros tipo pit bull terrier con JOGD.
• Se sabe que los niveles séricos de IgA se
correlacionan positivamente con la edad y los
perros menores de un año no tienen una
producción estable.
• Por lo tanto, se esperaría que los niveles totales
de IgA sean más altos en los perros de nuestro
estudio si fueran más viejos

33. Discusión
• Debido a que también se encuentra que las
concentraciones séricas de IgA varían ampliamente entre
razas, no se pueden hacer comparaciones significativas.
• Con respecto al papel de la IgA en el ectoparasitismo, se
especula que en la sarna humana el aumento de las
secreciones de proteasas en la piel por parte de los
ácaros Sarcoptes puede inducir en parte niveles elevados
de IgA en la sangre.

34. Discusión
• En el presente estudio, las concentraciones de citoquinas,
quimiocinas e inmunoglobulinas no parecían estar relacionadas con
la gravedad de la enfermedad, pero no se realizó un análisis
estadístico para evaluar las comparaciones entre los resultados de
las pruebas y la gravedad clínica
• Los perros tipo pit bull terrier que expresan más alto los niveles de
marcadores inmunológicos no fueron los que presentaron el mayor
número de ácaros o puntajes clínicos.
• Por lo tanto, la gravedad de la enfermedad cutánea puede no estar
directamente asociada con la expresión de ciertos marcadores
inmunológicos

35. Discusión
• Además, todos los perros tipo pit bull terrier con JOGD tenían
evidencia citológica y clínica de pioderma secundario de variada
gravedad clínica cuando las muestras se recolectaron para el
análisis.
• Un estudio previo sobre la dermatitis atópica humana y la infección
secundaria por Staphylococcus aureus en adultos informó que la
colonización elevada de la bacteria puede conducir a niveles altos
de IL-18.
• La infección bacteriana cutánea en la piel de los perros también
podría inducir cambios en las respuestas inmunitarias, lo que
dificulta determinar qué cambios estaban relacionados con la
demodicosis o la pioderma en los perros que se describen aquí.

36. Conclusión
• Según el mejor conocimiento de los autores, esta es la primera
evaluación por edades y razas del perfil inmunológico de los perros
con JOGD.
• Se requieren estudios adicionales como este para determinar si los
cambios en la respuesta inmune son inducidos por la presencia de
ácaros o son una consecuencia del crecimiento excesivo de ácaros.
• Además, los estudios longitudinales que evalúan la dinámica de los
parámetros inmunológicos asociados con la carga de ácaros, los
signos clínicos, la infección secundaria y la recuperación de la
enfermedad, serían útiles para determinar el papel de la respuesta
inmune en la patogénesis y la resolución de la JOGD

37. GRACIAS