La hibridación in situ es una técnica histológica que permite la detección de ácidos nucleicos en el tejido mediante el uso de sondas marcadas. Involucra la fijación de muestras, el uso de sondas complementarias a la secuencia objetivo y la detección de la hibridación mediante marcadores. Tiene aplicaciones en el diagnóstico de infecciones virales como HPV y en la detección de alteraciones genéticas como marcadores tumorales.

1. Hibridación in situ
Tomás García-Caballero
BASES MOLECULARES DEL CÁNCER
Xàtiva 2009

2. HIBRIDACIÓN IN SITU
I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico

3. Concepto
Técnica histológica que permite la detección in situ
de ácidos nucleicos
mediante el empleo de sondas.

4. Concepto
INMUNOHISTOQUÍMICA HIBRIDACIÓN in situ
MM
Anticuerpos Sondas
Detectan proteínas Detectan ácidos nucleicos

5. Concepto
IHQ e HIS son técnicas complementarias
IHQ +
HIS +
IHQ +
HIS -

6. Concepto
IHQ –
HIS +
IHQ e HIS son técnicas complementarias

7. Concepto
IHQ e HIS son técnicas complementarias

8. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico

9. Ácidos Nucleicos
Concepto
Tipos
ADN (Ácido Desoxirribonucleico)
ARN (Ácido Ribonucleico)
ARNr (Ribosómico)
ARNt (Transferencia)
ARNm (Mensajero)

10. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Están constituidos por unidades elementales denominadas
NUCLEÓTIDOS
Composición de los nucleótidos
Azúcar
Grupo Fosfato
Base Nitrogenada

11. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Nucleótidos
CH2P OO
OH
OH
O
OHOH
Ácido Fosfórico + Azúcar + Base Nitrogenada

12. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Azúcar
O
CHHC
CH2
CHHC
OHOH
OH
HO
1’
2’3’
4’
5’
O
CHHC
CH2
CHHC
HOH
OH
HO
1’
2’3’
4’
5’
Ribosa (ARN) Desoxirribosa (ADN)

13. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Grupo Fosfato
CH3 O
OH
CH2P OO
O
O-
O
OHO
(H3PO4)
P OHO
OH
OH
1’
2’3’
4’
5’
1’
2’3’
4’
5’

14. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Bases Nitrogenadas
Pirimidínicas
Citosina C
Uracilo (ARN) U
Timina T
Púricas
Adenina
Guanina
A
G

15. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Púricas Pirimidínicas
CitosinaC
Uracilo (ARN)U
Timina (ADN)T
Adenina A
Guanina G
Puentes de Hidrógeno
Unión entre bases Nitrogenadas

16. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Sentido cadenas: 5´ 3´
CH3 O
OH
CH2P OO
O
O-
O
OHO
1’
1’
3’
5’
5’
3’

17. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Cadenas antiparalelas
3’
5’ CH2P OO
O
O-
O
H
CH2P OO
O
O-
O
HO
CH2 PO O
O
O-
O
H
CH2 PO O
O
O-
O
H O
3’
5’
TT
AA
CC
GG

18. Ácidos Nucleicos
Estructura de los Ácidos Nucleicos
Secuencia de Nucleótidos
CCGG
TT
AA
AA GG
CCTT
AA
CCTT
AA
GGAA
TT
CCGG
TT
3’5’
5’ TAAgTCgCA 3’
5’3’

19. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico

20. Sondas
Secuencia de nucleótidos
complementaria
de la secuencia diana a estudio
MM

21. Sondas
Sondas antisentido y sentido
• SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucleótidos
complementaria de la secuencia diana
• SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de nucleótidos
idéntica a la secuencia diana, por lo que no puede hibridarse con ella
Secuencia diana
Sonda antisentido T A A g gT C C A3’ 5’
A T T C CA g g T5’ 3’
A C g C AT g A T5’ 3’
A T T C CA g g T5’ 3’Sonda sentido

22. Sondas
Tipos de Sondas
• Sondas bicatenarias (ADN)
• Sondas monocatenarias
Número de hebras
• Sondas de ARN (Ribosondas)
• Sondas de ADN
Naturaleza
• ARN
• Oligonucleótidos

23. Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Bicatenarias
MM
MM
• Permiten la detección de ambas hebras del ADN

24. Sondas
Tipos de Sondas
Sondas Monocatenarias
• En ADN, permiten la detección de una de las hebras
MM
• En ARN, es complementaria a su secuencia

25. Sondas
Marcadores
Son moléculas que se incorporan a un nucleótido
para permitir la detección de la sonda.
MM

26. Sondas
Marcadores
Tipos de marcadores
• Antigénicos
• Fluorescentes
• Inmunohistoquímica
• Visualización directa (FISH)

27. Sondas
Marcadores
Marcadores antigénicos
• Incorporan moléculas antigénicas acopladas a la base nitrogenada
• Los más usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluoresceína (FITC)
CH2 O
OHOH
P OO
OH
OH
PO
OH
OH
PO
OH
OH
MM

28. Sondas
Marcadores
Marcadores fluorescentes
• Incorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenada
• Los más usadas son: Fluoresceína, Rodamina, Texas red
CH2 O
OHOH
P OO
OH
OH
PO
OH
OH
PO
OH
OH
MM

29. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico

30. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijación
Permite preservar los ácidos nucleicos y la morfología tisular
DNasas ¡RNasas!
Degradación de ácidos
nucleicos diana
FIJACIÓNFIJACIÓN

31. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Fijador
FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas
Procesado rutinario de inclusión en parafina
Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o ácidos
Bouin
Zenker
B5
!

32. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secciones
Secciones de 5 µm en portaobjetos tratados
• Limpieza con alcohol (microtomo, baño, ...)
• Esterilización en autoclave (pinzas, ...)
Precauciones con las RNasas exógenas (condiciones de esterilidad):
• Uso de agua destilada en el baño para recoger las secciones
• Portaobjetos de caja recién abierta
!

33. Hibridación in situ
Procesamiento de las muestras
Secado de las secciones durante
1 Noche a 50-55 ºC
Almacenamiento de las secciones desecadas a –20ºC
Si no se realiza la HIS en
los días siguientes
Precauciones con las RNasas!

34. Hibridación in situ
Etapas
• Pretratamiento
• Desparafinado e hidratación
• Deshidratación
• Desnaturalización
• Hibridación

35. Hibridación in situ
Desparafinado e Hidratación
Se realizará de igual manera que la IHQ
Llevar la hidratación hasta Agua Destilada Estéril
Precauciones con las RNasas!

36. Hibridación in situ
Pretratamientos
Calor
Precauciones con las RNasas!
10 min, 95-99ºC
Baño María
Microondas

37. Hibridación in situ
Pretratamientos
Medios Enzimáticos
Precauciones con las RNasas!
Enzimas proteolíticas
PEPSINA (10 min TA / 5 min 37ºC )
PROTEINASA K (1 min TA)

38. Hibridación in situ
Deshidratación y secado
Precauciones con las RNasas!
Evita la dilución de la sonda
La deshidratación se realiza con alcoholes de graduación creciente
OH 70º OH 96º OH 100º
El secado lo podemos realizar
Al aire / campana
En placa térmica a 45-50ºC

39. Hibridación in situ
Desnaturalización
Permite la separación de las dos hebras de ADN para que
pueda ser detectada la secuencia a estudio
Sólo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN y/o
cuando la sonda sea bicatenaria

40. Hibridación in situ
Desnaturalización
95ºC durante 5’

41. Hibridación in situ
Hibridación
La sonda se unirá a la secuencia diana
bajo unas condiciones determinadas
MM

42. Hibridación in situ
Hibridación
Condiciones de hibridación
[Na+
]Temperatura
MM
MM MM

43. Hibridación in situ
Hibridación
Temperatura de hibridación
37ºC / 45ºC noche
Temperatura a la cual la sonda se hibridará con su diana

44. Hibridación in situ
Lavados de rigor (astringency)
Permiten aumentar la especificidad de la reacción
eliminando las uniones inespecíficas de la sonda
con secuencias parcialmente homólogas
SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X
SSC: Tampón citrato salino
Se realizan los lavados a 72ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC

45. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. HIS en Diagnóstico

46. Sistemas de Detección
• Biotina • Estreptavidina
• Fluorocromos
• Ac. anti-fluorocromo
• Fluorescencia (FISH)
• Digoxigenina • Ac. anti-digoxigenina

47. Sistemas de Detección
Sondas biotinadas
BB
1. Detección mediante Estreptavidina unida a la enzima
(Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)
EZ
EZ
E
Diana
2. Revelado con el cromógeno de la enzima
(NBT/BCIP o DAB)

48. Sistemas de Detección
Sondas biotinadas
EA-Peroxidasa DABEA-Fosfatasa Alcalina NBT/BCIP
Virus JC

49. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
BB
E
P
P
1. Detección de sonda biotinada con Estreptavidina-Peroxidasa

50. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
BB
E
P
P
TT
BB
TT
BB
2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a residuos
tirosina de proteínas próximas
TT
BB
TT
BB

51. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
TT
BB
E
P
P
3. Detección de la biotina de las tiramidas con más Estreptavidina-
peroxidasa
4. Revelado con DAB

52. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
Técnica convencional Amplificación con tiramidas
HPV

53. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
Caski (600 copias HPV16)
HPV

54. Sistemas de Detección
Amplificación con tiramidas
SiHa (1-2 copias HPV16)
HPV

55. Sistemas de Detección
Sondas antigénicas
AA
E
1. Detección mediante un anticuerpo unido a una enzima
(Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)
2. Revelado con el cromógeno
(NBT/BCIP o DAB)
Antígeno
• Digoxigenina
• FITC
Detección por Inmunohistoquímica

56. Sistemas de Detección
Sondas antigénicas
EBV - EBER
FITC–FA NBT/BCIP

57. Sistemas de Detección
Sondas marcadas con fluorocromos
FITCFITC
Iluminación con luz de
alta frecuencia (Ultravioleta)
Emisión de
fluorescencia de
frecuencia inferior
Visualización directa de la fluorescencia (FISH)

58. Sistemas de Detección
Sondas Marcadas con Fluorocromos
HER-2/neu
Centrómero
Gen HER2
FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization)

59. I. Concepto
II. Ácidos Nucleicos
III. Sondas
IV. Hibridación in situ
V. Sistemas de Detección
VI. Aplicaciones

60. Hibridación in situ
Aplicaciones
• INFECCIONES VÍRICAS
 HPV, EBV, CMV
• EXPRESIÓN GÉNICA EN DIAGNÓSTICO:
 Indicaciones terapéuticas (HER2, EGFR, TOP2a)
 Hematopatología (Translocaciones)
• EXPRESIÓN GÉNICA NORMAL:
 Confirmación síntesis proteica

61. Expresión génica normal
IHQ HIS
Testículo – Protimosina

62. HIS en Diagnóstico
HPV
• Virus ADN
• Técnica más sensible que la IHQ
• Permite el tipaje:
HPV 6,11
HPV 31,33
HPV 16,18 (factor de riesgo) Cáncer de cérvix

63. HIS en Diagnóstico / HPV
IHQ HIS

64. HIS en Diagnóstico / HPV
IHQ HIS

65. HIS en Diagnóstico / HPV
HPV 6,11
HPV 31,33HPV 16,18

66. HIS en Diagnóstico / HPV
HPV 16,18

67. HIS en Diagnóstico / HPV
HIS-HR
(16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)

68. HIS en Diagnóstico
EBV
• Detección de su ARNm (elevado número de copias):
 EBER: Epstein Barr Earlier RNA
¡Atención RNasas!
• Asociado a
Mononucleosis infecciosa
Linfomas
Carcinoma nasofaríngeo

69. HIS en Diagnóstico / EBV
Mononucleosis – EBER L. Burkitt – EBER

70. HIS en Diagnóstico / EBV
L. Hodgkin – EBER L. Hodgkin – EBER

71. HIS en Diagnóstico / EBV
Carcinoma Nasofaríngeo
EBER – Px / DAB

72. HIS en Diagnóstico / EBV
Carcinoma Nasofaríngeo
EBER – FA / NBT-BCIP

73. HIS en Diagnóstico / EBV
HIS - EBER
IHQ - CK

74. Controles
EBER
CONTROL
Sin sonda
Sonda sentido

75. HIS en Diagnóstico
CMV
• Virus ADN
• Infección oportunista en pacientes inmunodeprimidos

76. HIS en Diagnóstico / CMV
HIS - CMV

77. FISH
HER-2 / Carcinoma infiltrante de mama
Gen HER-2
Receptor HER-2Receptor HER-2

78. FISH
HercepTest
0 3+1+ 2+

79. FISH / HER-2
Algoritmo
Carcinoma Infiltrante
HercepTestHercepTest
00 1+1+ 2+2+ 3+3+
NegativoNegativo PositivoPositivo TrastuzumabTrastuzumab
IndeterminadoIndeterminado
HISHIS

80. FISH / HER-2
Cromosoma 17
Centrómero Gen HER-2
Sonda Centromérica Sonda HER-2

81. FISH / HER-2
Amplificado
No Amplificado
HercepTest 2+

82. FISH / HER-2
Casos 2+
INDICACIONES

83. FISH / HER-2
Casos 2+
 Casos 1+/2+
INDICACIONES

84. FISH / HER-2
Casos 2+
 Casos 1+/2+
 Casos 2+/3+
INDICACIONES

85. ALGORITMO DE HERCEPTIN
Carcinoma Infiltrante
HercepTest
0 1+ 2+ 3+
Negativo Trastuzumab
FISH / CISH
No A A

86. ALGORITMO DE HERCEPTIN
INMUNOHISTOQUÍMICAINMUNOHISTOQUÍMICA
Negativo (0, 1+)Negativo (0, 1+) Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+) Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+)
Hibridación “in situ”Hibridación “in situ”
POSITIVO
HER2/CEN17
>2’2
POSITIVO
HER2/CEN17
>2’2
BORDERLINE
HER2/CEN17
1’8-2,2
BORDERLINE
HER2/CEN17
1’8-2,2
NEGATIVO
HER2/CEN17
<1’8
NEGATIVO
HER2/CEN17
<1’8
Recuento adicional de núcleosRecuento adicional de núcleos
BORDERLINE NO AMPLIFICADO
HER2/CEN17: 1’8-1,9
BORDERLINE NO AMPLIFICADO
HER2/CEN17: 1’8-1,9
BORDERLINE AMPLIFICADO
HER2/CEN17: 2-2’2
BORDERLINE AMPLIFICADO
HER2/CEN17: 2-2’2
TRASTUZUMABTRASTUZUMAB

87. FISH / HER-2 - Polisomía

88. FISH / HER-2 - Polisomía
Centrómero del
cromosoma 17
Gen Her-2
Amplificación del gen
Múltiples copias
del gen debido a
polisomía del
cromosoma 17
CEN 17 / Núcleo ≥3

89. FISH / HER-2 - Polisomía
• No tiene influencia en la expresión de HER-2
Downs-Kelly E et al., Am J Surg Pathol 29:1221-1227, 2005
• No tiene efecto sobre el contenido de la proteína ni del ARNm
Dal Lago L et al., Mol Cancer Ther 5:2572-9, 2006
• En ausencia de amplificación no se asocia con sobreexpresión
Van den Bempt I et al., Curr Opin Oncol 19:552-7, 2007

90. FISH / HER-2 - Polisomía
• Factor principal en la sobreexpresión de casos 3+ no amplificados
Varshney D et al., Am J Clin Pathol 121:70-77, 2004
• Principal causa de respuesta a trastuzumab en casos 3+ FISH-
Hofmann M et al., J Clin Pathol 61:89-94, 2008

91. FISH / HER-2 - Monosomía
CEN 17 / Núcleo <1,5

92. FISH / HER-2 – Monosomía
• Define un grupo de pacientes con menor respuesta a trastuzumab
Risio et al., Oncol Rep 13:305-309, 2005
• En algunos casos con monosomía 17, la relación ≥ 2 es causada
por 2 copias de HER2 y una copia simple del cromosoma 17
por lo que no deben ser interpretados como amplificados
Persons DL et al, Arch Pathol Lab Med 130:325-331, 2006

93. CISH / HER-2
DigDig
PxPx
Px
Px
Px
PxPx
DAB

94. CISH / HER-2
HER-2 AmplificadoHER-2 No Amplificado

95. Duo-CISH / HER-2
Cinco Laboratorios europeos:
 Reino Unido
• School of Molecular Medical Sciences. University of Nottingham
• Medical School. Birmingham University
 Alemania
• Johannes Gutenberg Universitätsklinikum
 Suecia
• Universitetssjukhuset Lund
 España
• Universidad de Santiago de Compostela
VALIDACIÓN

96. Duo-CISH / HER-2
CISH
HER2
CISH
CEN-17
CISHCISH
HER2
CEN-17
Número de copias
dc-CISH
CEN-17
HER2
dc-dc-CISHCISH
Relación

97. Duo-CISH / HER-2
AP P
Sonda DNA – TRTR
IndoliumFast red
Hematoxylin
Sonda PNA – FITCFITC
Medio permanenteSecado

98. Duo-CISH / HER-2
x40

99. Duo-CISH / HER-2
x100

100. Duo-CISH / HER-2
x100

101. Duo-CISH / HER-2
x100

102. Duo-CISH / HER-2
x100

103. Duo-CISH / HER-2
 Duo-CISH combina las ventajas de
FISH y CISH
• Evaluación objetiva ( IHC)
• Contaje simultáneo de las señales de HER2 y
CEN-17 ( CISH)
• Campo claro ( FISH)
• Las señales en células normales y tumorales
representan un control interno positivo
ubicuo que falta en IHC
VENTAJAS

104. Duo-CISH / HER-2
 Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
VENTAJAS

105. Duo-CISH / HER-2
 Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
• Facilira la discusión de casos y
la formación
VENTAJAS

106. Duo-CISH / HER-2
 Campo claro
• El componente invasivo puede
ser fácilmente identificado,
reduciendo el riesgo de analizar
células no tumorales o no
invasivas
• Facilita la discusión de casos y
la formación
• Fácil evaluación del estado de
HER2 en TMA
VENTAJAS

107. Duo-CISH / HER-2
 No se requiere un
microscopio especial de
fluorescencia
• Economía
• No ambiente oscuro
• No aceite de inmersión
(40x-60x)
FISH
dc-CISH
VENTAJAS

108. Duo-CISH / HER-2
 Archivo
• Tiempo indefinido en el
archivo general
• Reevaluación de casos
• Estudios retrospectivos
VENTAJAS

109. FISH / Translocaciones
Cromosoma 14 Cromosoma 18
t(14;18)
Señal de fusión

110. FISH / Translocaciones
FISH normal FISH t(14;18)
IgH 14IgH 14
Bcl2 18Bcl2 18
Fusión
Translocación 14;18

111. FISH / Translocaciones
Cromosoma A Cromosoma B
Cromosoma A Cromosoma B
Split t(A;B)
Señal separación (split)

112. FISH / Translocaciones
Normal Translocación en Bcl2
Bcl 2Bcl 2
Split
Translocación en Bcl2

113. Agradecimiento

114. ¡Muchas gracias!