La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de (ADN) a partir de una sola molécula.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de (ADN) a partir de una sola molécula.
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
Inventada en 1985 por KaryB.Mullis
Premio Nobel de Química, 1993
La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79°C a 85°C), de ahí su nombre comercial mas conocido: taq polimerasa.
DNA molde o templado:
contiene la región que queremos amplificar.
Primers:
Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3‟, la polimerasa inicie la síntesis en dirección correcta.
Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA.
DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas temperaturas (TaqPol)
Termocicladora: Una máquina que haga ciclos controlados de temperatura (Máquina de PCR, PCRra)
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los ampliaciones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
PCR anidada
En esta variante de PCR, el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es altamente específica
PCR múltiple.
Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional, pero con mas de 2 primers, para amplificar varias regiones al mismo tiempo.
PCR in situ
Es una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto. Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza para ello una primera amplificación del ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera puede detectarse cantidades pequeñísimas del material genético.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Este tipo de PCR utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc.
1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.
PCR en tiempo real.
La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico
Huella digital genética
Test de paternidad
Detección de enfermedades hereditarias
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
Inventada en 1985 por KaryB.Mullis
Premio Nobel de Química, 1993
La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79°C a 85°C), de ahí su nombre comercial mas conocido: taq polimerasa.
DNA molde o templado:
contiene la región que queremos amplificar.
Primers:
Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3‟, la polimerasa inicie la síntesis en dirección correcta.
Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA.
DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas temperaturas (TaqPol)
Termocicladora: Una máquina que haga ciclos controlados de temperatura (Máquina de PCR, PCRra)
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los ampliaciones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
PCR anidada
En esta variante de PCR, el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es altamente específica
PCR múltiple.
Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional, pero con mas de 2 primers, para amplificar varias regiones al mismo tiempo.
PCR in situ
Es una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto. Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza para ello una primera amplificación del ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera puede detectarse cantidades pequeñísimas del material genético.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Este tipo de PCR utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc.
1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.
PCR en tiempo real.
La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico
Huella digital genética
Test de paternidad
Detección de enfermedades hereditarias
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
Droplet digital PCR | Aplicaciones y casos de éxitoBiodiagnostico
La tercera generación de PCR ya está disponible en Uruguay a través de Biodiagnóstico. Conozca el Droplet Digital PCR de Biorad, formas de uso y casos de éxito.
Lo que antes era indetectable con otros métodos, ahora se puede cuantificar con Droplet Digital PCR. Descubrilo.
1. PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa)
Universidad de la Salle Colombia
Facultad de ciencias agropecuarias
Medicina Veterinaria
Bogotá-Colombia
Luis G. Pérez
Yeili Álvarez Niño
Andrés Ricardo Avellaneda
2. Conceptos Claves
Cebador, es una cadena de ácido nucleico o
de una molécula relacionada que sirve como
punto de partida para la replicación del ADN.
3. ¿Qué es?
Es una técnica que permite amplificar rápidamente muestras pequeñas
de DNA, es decir, aumentar su cantidad de modo que sea suficiente
para poder analizarlas.
Si se comienza con un fragmento de DNA del tamaño de un gen la PCR
puede utilizarse para formar literalmente miles de millones de copias
en solo unas horas.
https://www.google.com.co/search?q=PCR&biw=1440&bih=805&source=
lnms&tbm=isch&sa=X&ei=y55rVM
4. Tipos de PCR
PCR in situ: permite la detección de ADN en el mismo lugar de la
muestra, sin tener que procesarla primero con técnicas de laboratorio.
Se suele utilizar para biopsias o raspados de células.
5. • PCR múltiplex: Es un método alternativo de la PCR de amplio
espectro para la detección de patógenos múltiples. En los ensayos
simples o múltiples, hay grupos de cebadores múltiples que se
utilizan en una PCR múltiple, cada uno de los cuales suele dirigirse a
un patógeno particular.
https://www.google.com.co/search?q=PCR&biw=1440&bih=805&source=
lnms&tbm=isch&sa=X&ei=y55rVM
6. • PCR con transcriptasa inversa, Se unas un ARN como molde inicial en
vez de un DNA, y emplea una transcriptasa para realizar la síntesis de
un DNA complementario al ARN
7. • PCR en tiempo real, Permite cuantificar la cantidad de DNA o ARN
presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de DNA especificas a partir de su temperatura
de fusión.
• PCR anidada: consigue amplificar muestras mínimas de ADN a miles
de millones de fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos
minúsculos.
11. Resultados
• Como resultado, el proceso sigue una curva de crecimiento
exponencial. Todos los reactivos necesarios se agregan a un tubo, que
se coloca en un termociclador. Este aparato permite fijar las
temperaturas, los tiempos y el número de ciclos deseados. El empleo
de un termociclador automático es posible gracias al uso de DNA
polimerasa obtenida de baterías termófilas como Thermus aquaticus;
la enzima de estos microorganismos puede soportar la fase de
calentamiento sin destruirse. Luego de treinta ciclos, completados en
sólo unas horas, la cantidad de DNA diana aumentara más de diez mil
millones de veces.
12. Utilidad
• Solo puede utilizarse para amplificar secuencias especificas de DNA
relativamente pequeñas determinadas por la elección de los
cebadores. No puede emplearse para amplificar un genoma completo
• Huella digital genética, permite identificar a una persona comparando
su DNA con el de la muestra obtenida, la PCR permite aumentar la
cantidad de DNA amplificando ciertos segmentos polimórficos.
• Detección de enfermedades hereditarias, los genes en estudio
pueden ser fácilmente amplificados por PCR para determinar alguna
mutación.
13. Identificación de Bordetella spp. Por PCR en
tiempo real
• Introducción: México lanzo una alerta epidemiológica en 2009 por
brotes de tos ferina en su región norte, el resurgimiento de la tos
ferina y sus cambios en la epidemiologia son diversos. El objetivo del
estudio fue identificar el agente causal de tos ferina en muestras de
exudados faríngeos y nasofaríngeos por rPCR en pacientes de Oaxaca.
• Se extrajeron ácidos nucleicos totales y se sometieron al protocolo
multiplex para la identificación de Bordetella spp por PCR.
14.
15.
16. Bibliografía
• Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. 2007. Introducción a la microbiología. México, Médica
Panamericana.
• Noriega-Bautista m, Arellanes-Velasco MF, Urbieta-Mendez E, Vásquez-Gómez EM, Velasco-Aquino VM,
Ramírez- Palacios LR. Identificacion molecular de Bordetella spp. Por PCR en tiempo real. Avan C Salud Med
2014; 2(1): 4-15.