Para estudiantes de medicina y profesores

1. Lafunciónfundamentaldelas enzimasesaumentarla velocidaddelas reacciones
quimicasque ocurren en los seres vivos. El comportamiento de esa velocidad y su
moduicacióndebidoa la presencia de diferentes agentes físicoso químicos constitu-
ye elobjeto de estudio de la cinética enzimática.
Lacaracterística más sobresaliente de estas reacciones es la participación de las
enzimas,locual significaque su velocidad está influida no sólopor la concentración
desustratoy producto, sinoademás y principalmentepor la presenciadeuna molécula
proteínieaqueno será alterada por la reacción en que participa.
En la medida que la reacción progresa la concentración delsustrato va disminu-
yendoyladelproducto aumenta, pero la concentración total dela enzima permanece
invariable.
Elobjetivofinaldela cinéticaenzimática esaprovechar losestudiosde velocidad
paraesclarecer losdiferentesmecanismos por loscuales las enzimas realizan su fun-
cióny correlacionar éstoscon la estructura tridimensional dela proteina enzimática.
En estecapítulosehará un estudiodelas característicasprincipales de la veloci-
daddelasreaccionesen que intervienenlas enzimas, así comode losdiferentes facto-
Wquepueden modificarla.
Condicionespara losestudioscinéticos
Para elestudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por una enzima y la
interpretaciónadecuada desus resultados serequieren algunascondiciones.
Teniendoen cuenta queson varios losfactoresque pueden modificar la velocidad
dela reacción sólo puede estudiarseun factor a la vez, con cuidado de que todos los
demás permanezcan constantes; sin embargo no pueden mantenerse contantes, la
Concentracióndelsustratoni la delproducto, pues su variación esel índiceque asegu-
nquela reacción está ocurriendo; parasalvar esa dificultadseintrodujoelconcepto
de velocidad inicial (va)que es la velocidad de la reacción cuando aún no se ha
Wnsumidoel10% delsustratoinicial. Esto obligaa realizarprimero algunos ensayos
endiferentestiemposdeincnbación, de formatal que pueda Q a r r elintervalo nece-
sarioPara estar seguro de que en el estudiosemiden velocidadesiniciales.

2. Fig. 16.1. Efecto de la concentración de
enzima. La recta que se obtiene
indica una relación de pruporiio-
nalidod directa entre la velocidad
de la reacri6ii y la concentración
de la enrima, lo cual es el funda-
mento de toda la ein6tiia
mriniitira.
Además, la medida de la velocidad inicial evita que las determinaciones estén
intluidas por otros factorescomo:
1.Si la reacción es reversible, la velocidad de la reacción inversa aumentará el1la
misma medida que la concentración del producto y descenderá la velocidad de
transformación del sustrato.
2. Si uose proporciona sustratoen excesosu concentración descenderá con eltienipo,
loque provocaría una disminución progresiva dela velocidad.
3. El producto de la reacción puede inhihir la actividad de la enzima.
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, puede medirse por 2
tipos de procedimientos, utilizando una técnica discontinua (demuestreo)en la quese
toman muestrasde la mezcla de reacción en diferentestiempos, sedetienela reacción
y se analiza el contenido de sustrato o producto en las muestras. Tainhiéii puede
aplicarse una técnica de observación continua en la que sehace uso de una propiedad
física distintivadel sustrato oprodncto u otro participante de la reaccioiiquese puede
medir cuantitativamente sin interferir el desarrollo de la reacción, cornopuede serel
cambioque seproduceen elespectro deabsorción debidoala formación del producto.
Este tipode procedimiento eselmás aconsejable,pero no siempreesfactible.
La velocidad inicial dehe medirse por la variación de la concentración del pro-
ducto por unidad de tiempo, siempre que ello sea posible, pero en ocasiones no se
dispone de los procedimientos necesariamente exactos y se hace midiendo la varia-
ción de la concentración del sustrato.
En la práctica losestudios cinéticos se realizan de la forma siguiente: en primer
lugar seprocedea determinar el tiempodeincnbación comoya fue explicado,después
seprepara un conjuntode tubos de ensayo dondese encuentran todos los conipoiien-
tes de la mezcla de reacción (buffer,sustrato, activadores, etcétera) menos la enzima;
esta mezcla se coloca en baño de temperatura regulable, fijando ésta en un valor
determinado, donde también seincuba por unos minutosla solución que contiene la
enzima. Por último, se añade a cada tubo la solución de enzima; auxiliados de un
cronómetrose mide el tiempo de reacción a partir del momento en que seañadió la
enzima, al transcurrir eltiempo indicadose procedea detener la reacción para añadir
algún agente desnaturalizante de proteínas, uno de los más empleados es el ácido
tricloroacético(TCA),seprocede entoncesa determinar laconcentración del producto
(odelsustrato),secalcula ladiferencia con laconcentración inicial (queen elcasodel
producto es cero) y este resultado sedivideentre el tiempo de incubación, con locual
seobtieneel valor de la velocidad; después seconstruye una gráfica cartesiana donde
serepresenta la velocidad inicialen el ejede lasordenadasyelfactor queseha variado
en el eje de las abscisas, la curva que se obtiene es la variación de la velocidad en
función de la variación del factor estudiado.
Los factoresque pueden modificar la velocidad de la reacción son la concentra-
ción de la enzima, del sustrato, de los cofactores y de iones H+(expresadas conio
unidadesdepH), asícomola temperatura,la presenciadeinhibidores y activadores.Se
estudiaráa continuación cada uno de ellos.
Efeeto de la concentraciónde enzima
Si se procede de la forma indicada pero haciendo que cada uno de los tubos de
ensayocontenga una concentración diferente (creciente) de enzima, al procesar los
datosobtendremos una gráfica (Fig.16.1).
La obtención de una línea recta que pasa por el origen de lascoordenadasindica
queexisteuna relación deproporcionalidad directa entre la velocidadde la reacción S
laconcentración de la enzima, que puede expresarse por la ecuación

3. loquesignüica quela reacción esde primer orden con respecto a la concentración de
e&a; esta relación constituye elfundamentode toda la cinética enzimática.
~~t~resultado era de esperar, si la concentración de sustrato está en exceso, a
quese aumentala concentración de la enzimaseincrementa laformacióndel
mmplejoESy una vez formado ésteseproducirá la transformación delsustrato.
La actividad~atalíticade las enzimas seexpresa en unidades de enzima, gésta es
*&ente igualala cantidaddeenzimaquecatalizalatransformaciónde1micmmol
desustrato por minuto, bajo condiciones específicas.Cuandono se posee la enzima
P"B7
sinouna preparación impura,puede medirseen unidades por mL osu actividad
epeeíf~caen la preparación comounidades por mg de proteína total.
La relación de proporcionalidad directaentrela velocidady la concentración de
enzimapermiteladeterminación dela concentración de alguna deellasen loslíquidos
otejidoscorporales. Basado en este principio sedeterminan en ellaboratorioclínico
lasconcentracionesséricasdetransaminasas, quinasas, peptidasas, etcétera.
Efectode la concentraciónde sustrato
Enestecaso laúnica diferencia entre lostubos de ensayoradica en queelsustrato
estáen cada uno de ellosen concentración diferente (Fig.16.2).
La primera explicaciónconvincente para estecomportamiento fueexpriestapor
LeonorMchaellisy MaudMenten en 1913,quesegún ellosla reacción se produce en
Zetapas: la unión de la enzima (E)con elsustrato(S)para formarun complejoenzi-
ma-sustrato(ES)demanera rápida, ylatransformacióndelsustratoenproducto (P)con
laliberaciónde la eniima, que resulta la etapamáslenta
k, k,,,
E + S + ES & P + E
k2
dondek,, k, y kc,son las constantes de velocidad específica para cada etapa de la
reacción.k_,se conocetambién comonúmero de recambio de la enzima.
Comola segunda etapa esel paso limitante, la velocidaddela reacción depende
dela descomposicióndel complejo ES según la ecuación:
sise puedemedir [ES]en diferentesmomentoses factiblecalcular la velocidad,pero
estonosiempreesposible,locual obligaa deducir una ecuaciónque permita calcular
lavelocidadenfunción de variables que sepuedan medir.
Comolaformación de ESesreversible ysedescomponelentamente en producto,
seestableceráun equilibrioentreE, Sy ES cuando su velocidad de formación(vJ sea
igual a su velocidad de descomposición (v,) y éstas vienen dadas por las conocidas
~uacionesde velocidad:
cuandovr=vdtendremos que:
Fig. 16.2. Efecto dc la conceiitració~ide
sustrato. En In mctliila que la con-
centración dc sustrato es mayor,la
velocidad de la reacción cs nia-
yor, sin embargo, los incrementos
en la velocidad no son uniformes,
sino cada vez menores; cuando se
alcanza un deterniinado valor de
la coneentraciún de sustrato, la ve-
locidad seIiaeeprácticarnentc cons-
tante, en ese momento la reacción
Iia alcanzado la Vni. La coneen-
traelón de sustrato para la cual la
velocidad de la reacción cs igual a
VmIZ es la constante dc Michaellis
(Km), qiie es un índice de In nfini-
dad de la enzima por el sustrato.

4. el cocientede las 2 constantes,que es la constante de disociacion del complejoES
recibe elnombredeconstantedeMichaellis(Km).
La enzimalibre(E)será iguala la enzimatotal (EL)menosla queseencuentraen
forma deES. Siseintroducenestasconsideracionesen la ecuacion (S),setieneque:
sisedespeja [ES]
[ES]= [Et][S]/(Km+[S]), (6)
sustituyendo[ES]por suequivalenteen (1)seobtiene:
v,= -
k,,, [E,] [SI
Km + [S]
En estaecuacioncabeconsiderar3casos:
1.Cuando [S]>>>Km: en estecaso el denominador Km +[SI es casi igual a [S]y
simplificandoobtenemos:
Lasconcentracionesmuyelevadasdesustratoproducenun efectodesaturación,o
sea,todos los centrosactivosde las enzimashan sidoocupados por el sustratoy
casitoda laenzimaseencuentraen forma deES. Teniendopresentelaecuación (1)
es posible inferir que en ese momento se habrá alcanzado la mayor velocidad
posible para la reacción que sedenominavelocidadmáxima (Vm).En estosmo-
mentosla velocidadsehace independientedela [S],osea,esdeordencero. Asíse
obtienela forma habitual dela ecuacióndeMichaellis:
v,= v m [SI
Km + [S]
2. Cuando[SI<<Km: enestecasoelvalordeldenominadorserá prácticamenteigual
a Kmyla ecuaciónsetransformaen
Vmv,=-. [SI
Km
elcocientedelas2constantesVmIKm esuna constantey por lotanto,la velocidad
dela reacción esdirectamenteproporcionala laconcentracióndesustratoo,dicho
deotraforma,esdeprimer ordencon respectoa la concentracióndesustrato.
3. Cuando[S]=Km:enestecasoeldenominadorpasa aser 2[S]quealsimplüicarnos
queda:

5. esto significa que el valor de Km es igual a la concentración de sustrato,
la velocidad inicial es igual a la mitad de la velocidad máxima; en
momento la mitad de las moléculas de la enzima está en estado libre y
la otra en forma de ES.
silacurva tienesiempre la misma forma la diferencia entre ellasestarádada por
losvaloresdeVm y Km,de ahíqueéstosseconozcancomolosparámetros cinéticosde
heeuaeión deMihaellis. Analicemosbrevemente elsignificadode rada uno deellos.
Vm se alcanza cuando las moléculas de sustrato han ocupado todos los sitios
B,.&vos detodas las moléculasde la enzima, por loque la velocidadde reacción en ese
momentosólodependede lacapacidadquetenga laenzimapara transfomarelsustrato.
A parürdelvalordeVm sepuede calcularel número de recanibio de la enzima;si una
solución 10dMde anhidrasa carbónica que cataliza la formación de 0,6 M de H.CO,
porsegundocuandoeskícompletamente saturada de sustratosegún la ecuación
podemoscalcular ke,,pues
Vm = kcal [Et]
estosignificaque la enzima produce600 0OOinoléculasde H,CO, por seguiidoy éste
esprecisamenteel significadodel número de recambio.
La Km, comola hemosdefinido(otrasdefiniciones pueden originar otros signifi-
cados),esiguala laconstante de disociacióndel complejoESy por ello representa una
medida dela afinidad delaenzimapor elsustrato,deformaquemientras mayor sea la
afuiidad menor seráel valor de la Km. En la tabla 16.1se relacionan losvaloresde Km
y dek_,de algunas enzimas.
Tabla16.1. Valores de la Km y la kcz,,de algunas enzimas
Enzima
Anhidrasacarbónica
Acealcoiimaestearasa
Catalasa
l h a l a s
h m m a
Ureara
cu?, 1.2 x 10-z 1.0 x 10h
Acetilcolina 9,s x 10.' 1.4 x 10'
%O2 2,s x 10.' 1 , ~x 10'
Fumarato 5,0 x 10~" 8,O x 10'
Malato 2,s x 10' 9.0 x 10'
U m 2,s x 10.' 1,0 x 10'

6. Fig. 16.3. Ke1irescnlaciÚii de I.iriewcaer
Uiirk. lin la ~ráfica,dohleniriite
rrcíprora al ploteai. llr,,centra 11
[S], se ubticiie uria iinca verla cnn
i~itcrreptosdc IWni vara las ordc-
n u d a y -llKrn pai-n la al~cisas,)
periiiite la detcrrninaiióii de IUS
parámcti-os riiiéfirosde blichaillis
ron nijs ~ractiladque la gráfica
IiiperI>Úlira.
Para determinar de manera experiniental los valores de Vm y Km resulta niuy
engorroso elempleode la curva hiperbólica, pues sería muy difícildibujarla ajustada
si los puntos experimentales están muy dispersos, además resulta difícil coiisegi~i~
concentracionessuficieiitementeelevadasdesustratopara alcanzar Vm, ocasiiiiiprac.
ticahlemedir las bajas velocidadesinicialescon pequeñasconcentracionesdesustrato,
Todasesta5dificultadesseevitancon elmétododedeterniinacióndeLineweavery Burk,
esteprocedimientoresultadeuna tramfomación delaecuacióndeMicliaellisy consiste
en tomar losinversosdeésta, representarelinversodela velocidad inicial Wv,,)enel rje
de las ordenadas y el inverso de la concentración de sustrato (l/[S1)en el eje de las
ahscisas; latransformaciónde una ecnacióna la otra esmuy sencilla.
Al tomar los inversos en la ecuación de Michaellis seobtiene
descoinponiendo el sumandoysimplificandoseobtiene
Ol~sérveselaIio~nologíaconlaecuación generaldeniialinea recta deltipoy=ai+b.
cuya pendientees KmNni ycon el interceptoiguala 1Ninpara lasordenadasy -l/Kin
para las ahscisas (Fig.16.3).
Esta línea recta, la gráfica doblemente recíproca, se debe preferir a la gr6fica
hiperbólica comométodode detcriiiinacióiideVm y Km,ya queuna línearecta piiedc
dibujarsey extrapolarsedeforma másrigurosa quecualquiercurva. Esteconociniiento
esniny importantea la hora de analizar losinliibidores enzimáticos.
Reacciones con 2sustratos
En mucha7reaccionesenziniáticasdeiniportancia biológica seutilizan 2 sustiñtoS
(0un sustratoyuna coenzima)para forniar 2 productos,por lociral la ecuacibngeneral
sena
A+R -P+Q
El mecanismo deestas reaccionesesmás comple,joqueaquéllas en queiiiteriene
un solosustratoysus eiuaciones cinéticas más difícilesde deteniiinar.
El Iieclio más sobresaliente es el orden en que los sustratos se coinhinaii con la
eiiziina y elorden en que se liberan los productos. Atendiendo a este aspectose Iiali
distinguido3inecanisnios ixásicosde reaccioiiesbisustrato.
Mecanismoordenado. Los sustratosse enlazan y los productos se lihcraii en ilil
orden obligado comose muestra a continuación:
donde EAB (coniple,joenziina-siistratos) y EPQ (complejo enzima-prodiictos) se
intercoiivierten rápidamente (Fig. 16.4).
El ejemplo más abundante son las desliidrogenasas que funcionan con NAW
como coenziiiia aceptora de Iiidrúgenos, en las cuales la enzima se une primero a la

7. E EA EAR EPQ P EQ 0 E
w.16.4. Mecanismo ordcnado con 3 sustratos. La eiilinin (Eldebe iinirsc primer<,cun rl sustrato
y formar el compleio EA, pies el sitio de iiiii<inde B ne es acccsihle a sic sirstrata. La iiriiún
de B da lugar a la formación del cotiipleji, Irriiario Bll que se transforma lentanienle en cl
complejo enzima-productos (EPV). qur deqiiifr lihmi tambifn suc pridurtos dc fornia
ordenada.
coenzimay con posterioridad a1sustrato, liberan primero el producto oxidado y des-
pnéslacoenzimareducida.
E +N A D ' d E:NAD' + LACA E:NADA:LAC
E:NADH:PIR d P I R +ENADH +E + NADH
Esta reacción está catalizada por la enzima lactato-deshidrogenasaque oxida el
lactato(LAC)en piruvato (PIK)con la reducciónsimultánea delNAD'a NADH.
Estemecanismodesdeelpuntode vistaestmcturalsefundamenta en queelcentro
activonoestá totalmenteforniado en ausenciadelossustratos y la unión del prinicrode
40s produceun canibioconforniacionalen la enzima quecasicrea elsitiodereconoci-
mientopara elsegundo,deesta manera elorden deunión delossustratosesobligado.
Mefanismode orden azaroso. Los sustratos pueden unirse a la enzima en cnal-
qGe~orden,loquehace suponer que existeun sitiode unión diferentepara cada uno
deellos (Fig. 16.5).
Un ejemplo típico de estas enzinias son las quinasas, que en el caso de la
hexoquinasasería:
En esta reacciónlaenzimatransfiere un grupofosfatodelATPa la glucosa(GLC)
Paraformarglucosa-6-fosfato(GLP)y ADP. Comosemuestra, la enzima puede unir
Primeroa la glucosaoal A'I'Py liberar la glucosa-6-fosfatoantes odespuésqueelADP.

8. Fig. 16.5. Meeanisnio de orden aleatorio ron 2 surtratos. La enzima (E)presenta sus 2 centros ;rtivor
xcesibles ssus respectivos sustratos A y B, por eso cualquiera de ellos puede unirse ~irirnero
para formar los compkjos EA ó EB: a estos complejos se une el otro sustrato ) se forma rl
iomplc,jo tcrniirio EAB, que se transforma en el complejo enzima-productos EPQ que
puede liberar sus productos cn cualquier ordcn.
Mefanismopingpong.Secaracteriza porque un producto seforma y libera antes
de la incorporación del segundo sustrato; esto puede explicarse por la existenciade
una enzima en 2 formas (E y E*),una capaz de unir al primer sustrato y la otra al
segundo.El pasodela ennma deuna forma a otra demanera constantefueloquequiso
denotar Clelandcuando denominópingponga este mecanismo.
Este mecanismo seilustra en la figura 16.6.
E EA E E'B E
Fig. 166. Mecanismo ping pong. La enzima (li) s6lo piwdc iinirse al sustrato A foriiiaiirl~~e'
complejo EA que lihera el producto P y dqja niodifieada la enzima (E*), s61a etitiillccs
puede unirse al sc~iindosustrato B y formar el cenipleja E*U que libera el producto Q
quedando la enzima en su forma inicial para comenzar un nuevo cielo iatalítico.
290 ihqufmica Uedjca

9. ~1 más característico eselde las transaminasas (enzimasque transfieren
gniPOS-o), en elcasodela transaminasa glutámico-pirkicotendremos
E+ALA E: ALA, E*: PIR --.E* +PIR
p + K G A * E : K G -E*:GLU-E+GLU
Enestareacciónlaenzimaseuneprimero a la alanina (ALA)formandoelcomple-
jo-aminasa-alanina (E:ALA),que al convertirla alanina en pirúvico (PIR)deja
modificada también a la enzima (E*), esta forma E* puede unirse al ácido
a&gluíárico (KG)queal hmsformarse en glutámico(GLU)regenera laformaori-
dela hansaminasa. La deducción de las ecnacionesde velocidadpara cada uno
deestostipos de reacciones va más allá del alcance de este texto.
Laconcentración de cofactoressueletener un efectosimilar a la concentración de
svstrato.
Lacoincidencia de las 2 gráficas es un hechoexperimentalimportante para afir-
marque loscofactores se unen a la enzima por un sitio específicoy en una relación
estequiométricaque explicaelfenómeno de saturación observado; estesitiopudiera
sereleentro activo.
EfeetodelpH
Sirealizamos una experiencia como la descrita pero haciendo que la mezcla de
incubacióncontenga soluciones hufferde diferentes valores de pH, seobtendrá una
g~%cacomola quese muestra en la figura 16.7.
Como se observa, la curva tiene una forma acampanada con una zona central
estrechaque secorrespondecon los mayores valores de la velocidad; al valor de pH
dondeseobtienela mayor velocidadseledenomina pH óptimo.Esta gráficaseexplica
teniendoen cuenta que el pH modifica elestadodedisociaciónde losgrupos químicos
presentesen laenzimaoen elcomplejoenzima-sustrato, con loque puedemodificarse
unasveceslaunióny otraslatransformación.En valoresextremosdepH (cercade0ó 14)
puedeproducirse desnaturalización de la proteína enziniática, loque contribuye a la
Pocaactividad observada en esta zona.
El pH óptimo es un valor caracteristico para cada enzima y expresa que en ese
valor la enzima se encuentra en su conformación más activa. Supongamos que los
D'Uposqueforman elcentro activo puedan existir en 3estados de disociacióndepen-
dientesdelpH,
Fig. 16.7. Efecto del pH. Se obtiene una
figura en forma arnnipaniida B m -
de se puede determinar la zona dc
pH iiptinio. Obsérwse que In dia-
niiniiriím o aumento del pll en
relaeiiin con el pH 6ptimo provo-
ca iiiia disiiiinuci6n de la vcloii-
dad de la rencri6n.
siel estadomás activoesEH-ohtendremosla curva descrita que esla dela mayoría de
lasenzimas;sifiiera EH, la curva carecería de la rama ascendente,comosiicedecon la
Pepsina; sifuera E=carecería de la descendente, comosucede con la tripsina; estas 3
sihiacionesse representan en la figura 16.8.

10. Efecto de la temperatura
I'igiirn 16.8. Difereiirias en el pH ólitiniu.
I>cpciidi~ii<lode lii forma iónica
donde la enzima tiene su mayor
actividad sc pueden ohtenrr cur-
vas diferentes que reflejan qinr
rada enriim tiene un pH 6ptinio
rili.actcristire,eitiisedebea la pre-
seniiia en rl centro activo de la en-
rima de Crupas químicos que tic-
neii dil'ci-cnir reacción ante los
ranibios de pII.
Kg.16.9. Efecto dc la teniperatura. La ve-
locidad de la rcncrión auineiiia ron
la temperatura, pues ésta es im rc-
fleje del sun>entorlc la energía
cinetira rlc los componentes de la
reaeri6n. lo cual favorece los chu-
ques lnternioleeulares: después dc
cse incremento de velocidad al au-
mcnwr la teniprriitura, se produ-
cen alteraciones cn la estructura
tridimensional de la proteína
cnrimática que detfrminan una
disminución cn la velocidad de
reacción.
Un experimento semejante a losdescritos, pero esta vezcon lostubos de ensayo
bajo temperaturas diferentes,muestra susresultadosen lafipra 16.9.
La influenciade la temperatura sobrela velocidad dela reacción esun problema
complejoen elcual intervienen variosfactores,entre ellosel aumentode la energíadel
sistemaalaumentarla teiiiperatiira,locual hace quelosreactantes posean una cner@a
cinética mayor y por tanto estén más próximos al estadoactivado,además, losefectos
desestabilizantes de la temperaturasobrela estructura tridimensionalde la proteína
enzimática son imprescindibles para su acción.
Teniendoen cuenta al menosestos 2 factorespuede resuniirse elcomportainiento
de la velocidad en funcióndela temperatura comosigue.
El aumento de la temperatura refleja un aumento de la energía cinética de las
moléculas,lo cual favorecela colisiónentrelas moléculasde enzima y sustrato, rnieii.
tras mayor seala temperaturamayor eselnúmero dechoquesymayor lavelocidadde
la reacción;pero a partir de un valorde temperaturacomienza la desnaturalizaciónde
la proteína enzimática y con ello la pérdida de la actividad que se observa en los
valoreselevadosdetemperatura.
Efecto delosactivadores
Como activadores enziináticossedefinen a las pequeñas moléculas,generalmen-
teionesinorgánicos, queson requeridos, oal nienos estimulan, la actividad catalitica
de una enzima,y al contrariode loscofactores, no son participantes explícitosdela
reacción. Aun cuandopueden plantearse diferentesformasdeactuar, noslimitai-ernos
a los 2 casos mejor conocidos: la interacción obligatoria con la enzinia libre y la
interacción obligatoriacon elsustrato libre. En elprimer casoseencuentranmuclias
enzimas queposeen ionesmetálicosen su centroactivo como la carboxipeptidasa que
contieneZn"; otras enzimasparecen requerir la presencia deun ion para estabilizarsu
conformación de máxima actividad catalitica.
La reacción general puede ser descrita de la forma siguiente:
E + A EA
EA + S -+EAS -EA + P
En elsegundocaso seencuentran enzimas que catalizan reacciones en las cuales
intervienennucleósidosdi ytrifosíatados, querequieren dela participación siniultá-
nea de un catión divalente (especialmenteMgz+)en cantidadesestequiométricds. Las
investigacionessobreestasreaccioneshan mostrado queun mecanismoprobable para
esta activación esla combinación del ion con el sustratoprevio a sninteracción conla
enzima. El verdadero sustratode la reaccion sería el complejo sustrato-catión, el es-
quema de reacciónsería:
SA + E -+ESA -+E + PA
La deducción de las ecuaciones cinéticas para estos casos rebasa los marcos de
este texto.

11. a& delosinhibidores
inhibidores enzimáticos son sustanciasque tienen en común la propiedad de
disminuir la velocidad de lasreacciones catalizadas por lasenzimas. Casi siempre se
distinguen 2tipos generales de inhihiciúo, la reversible y la irreversible, en el primer
easoel inhibidor forma con la enzima un complejo enzima-inliihidor (El)unido por
fuenm no covalentes y que por tanto puede disociarse; en el segundo, se producen
modificacionescovalentes de la enzima que no pueden eliminarsefácilmcnte. En este
c a p f ~ osólosetratará de losprimeros.
para estudiar el efectoy tipo de los inhibidores se realira una experiencia igual a
ladeterminación del efectode la concentración de sustrato sohre la velocidad, pero
&oraencadaunode lostnbos de ensayoseha añadido un inhibidor en unaconcentra-
fija. Como en los casos anteriores los resultados se llevan a una gráfica y de
amedocon ésta seclasifican losinliihidores; sóloseestudiarán los casosmás típicos.
En lafigura 16.1Usepresenta una gráfica en la que aparecentambién los resulta-
dosobtenidos sin el inhibidor.
La gráficanos indica que para casitodas laiconcentracionesdesustrato utilizada?
lavelocidad de la reacción siemprees menor en presencia del inhihidor, sóloen con-
centracionesmuy elevadasdel sustratose logra superar la inhibiciúnyesohace que la
Vmseaigual en amboscasos; estoimplica que seniodifique el intercepto del ejede las
abscisasquecomosabemoses una hiiciúii de la Km.
SilaKm está aumentada y la Vni está sinniodificaciún,sc diceque elinhibidor es
de tipo competitivo. El hecho de que la Vm no se altere significa que la capacidad
catalíticadelaennma esla misma con inhibidor osin él. El aumento de Km indica que
existeuna disminuciún de la afinidad de la enzima por el sustrato; estos hechos son
compatiblessi suponemos que el inhihidor es capaz de unirse al centro activo para
impedir la entrada del sustrato; si el sustrato no entra al centro activo no puede ser
transformado por la enzima y esto explica la disminucih de la velocidad, o sea, se
estableceuna competencia entre el sustrato y elinhibidor por ocupar el centro activo
delaenzima. Cuando lasconcentraciones de siistrato son elevadísimas la probabili-
daddeuniónenzima-sustratoesmuy alta ypor ellosealcanza la velocidad ináximade
lareacción.
El esquema de la reacción en presencia de un inhibidor competitivo sería:
Y para ellosedefinen2 constantes dedisociación,la Km que ya conocemosyla Ki para
la disociación del comple,joE1y resulta
elvalor aparentede KmkLque seobtiene con el inliibidor,se relaciona con la Km sin el
inhibidor por la ecuación

12. Nótese que parte de la enzimaseencuentra en forma decomplejoE1que no da
producto,pues no puede unir alsustrato,loquesignificaqueexisteuna disminución
del númerodecentrosactivosútilesy, por tanto,una menor velocidaddela reacción.
Una característicadelosinhibidorescompetitivosesquesu estructuraessemejan-
te a la delsustrato. En la figura 16.11semuestra cómola succinatodesbidrogenasa
puede ser inhihida de forma competitiva por el malonato,cuya estructura es muy
similara ladel succinato,queeselsustratonaturaldela enzima.
Fig. 16.11. Mecanismo de la inhihiciún com-
petitiva. La similihid estructuraldel
inhibidor con cl sustralo hace que
aquél pueda unirse al centra acti-
vo, pero sus diferencias le impi-
den la transformación. La enzima
auccinato-deshidrogenasa une al
ácido sucrinico y actúa sobre los
hidrógenos colocados eii carbonos
adyacentes. Cuando el ácida
malónieo, que tiene una estructu-
ra similar, se une al centro activo
de la enzima produce una inhibi-
ción, pues no puede ser transfar-
mado, quedando unida al centro
activo y, por tanto, impide la en-
trada y transformación del sustrato
verdadero.
Wbieióo no competitiva
,.
disminuyedealgunaformalacapacidad catalíticadela enzima.Seacepta quelaunión
enzima-inbibidorse produce en un sitiodiferente del centro activoy que esa unión
En la figura 16.12aligualqueen elcasoanteriorsemuestran ademáslosresulta-
I- dosdelexperimentosinel inhibidor.
, "M
1.- 1-
~d 1%
Fig. 16.12. Inhihidares no competitivas. El
inhibidor no competitivo no se alo-
ja en el centro activo y no puede
impedir la entrada delsustrala,pera
de alguna forma dificulta su trans-
formación; en supreaencialaseur-
vas que se obtienen difieren en el
valor de INm, pero no alteran el
valor de -1lKm. Variaciones en la
concentración del inhibidor dan
origen a una familia de curvasque
se cortan en cl eje de las abeisas en
el punta -I/Km.
Y"
I
7
VM
,
modificalas propiedades catalíticasdela enzima,posiblemente modificandola con-
formación delcentroactivodeforma queno impidela unión delsustratoperodificul-
ta grandementesutransformación.
Elesquemadelareacciónconla participacióndeun inhibidor nocompetitivoserá
., Los efectos de este inhibidor sobre los parámetros cinéticos son contrarios al
,/' anterior,seobservauna disminucióndela Vmsinalteracionesdela Km; nisiquieraen
,/ , '.
concentracioneselevadísimasdesnstratoselogra eliminar la inhibición.
.,' ,/ " , !
,'
Si la Km no se ha modificado quiere decir que no existe impedimento para la
-':, unión dela enzimacon elsustrato.oerola afectacióndela Vm indica aue elinhibidor
E + S +ES+ E + P
E + I d E I
ES + 1 +EIS
E1 + S +EIS
La enzimaexisteen un estadolibrey enformadevarioscomplejos(EI,ESyEIS)
de los cuales sóloES da productos. Si suponemosque la unión de S a la enzima no

13. iduyesobrela unión de1y viceversa,entoncesla constantededisociacióndeE1será
iguala la deEISyvienedada por cualquieradelasecuacionessiguientes:
El valor aparente deVm' queseobtieneen presencia del inhibidorserelaciona
con la Vm dela reacciónsin el inhibidor por la ecuación
[Il~ m '= Vm. (1+ -)
Ki
En estecasotambién la enzima existeenforma devarioscomplejosde loscuales
sóloESpuededar productos,pero no existeningúnimpedimentopara la unión con el
sustrato;la existencia deesoscomplejosdetermina una disminucióndel número de
centrosactivosútilesen la preparacióny, por tanto,una disminucióndela velocidad
dereacción.
Los inhibidoresno competitivosno son análogosestructurales del sustrato; el
iodoacetatoesun potenteinhibidorno competitivodelasenzimasqueposeen grupos
sulfibidrilosen,ocerca de,sucentro activo.
Algunos medicamentos utilizados diariamente en la práctica médica son
inhibidoresennmáticos,comoelcasodelassulfamidasqueseemplea en el tratamien-
to deinfeccionesbacterianas.
En general lasarmasquímicassuelensertambiéninhibidoresenzimáticosqueal
bloqueardeterminadas reaccionespuedeu dañar un órganootejidoespecífico. sila
enzima queresulta inhibidaestápresentesóloen él,oalorganismoen su totalidad si
laenzimainbibidaestámuy distribuidaen la economía.
Laluchacontralaproducción, almacenamientoy utilizacióndelasarmasquími-
cas debe constituir una posición de principio de todo científico,pues es parte del
comportamientoéticoimpedir el uso de los avances de la ciencia en perjuiciode la
humanidad.
Resumen
Laeinéticaenzimsticaesla partedela enzimologhqueseocupadelestudiode
la velocidad de las reacciones enzimáüeasv de las factores aue la modiscan.
En los&dias einéüeosse debenobsekar algunasreglasquepermitan hacer
una interpretación ademada delas resuliadas, wmo son medir siempre veldda-
des ini&es y variar en cada experimento sólo uno de las factores que pueden
alterarla velocidad. Los principalesfactores que iníinyensobrela velocidad dela
reaeO6n sonlasconcentracionesde etuimas, mistraiosy wfactores, la temperatu-
ra, elpH y la presencia de activadoreso inhibidores.
La velocidad de las reacciones enzimátieases diredamente proporcional a la
wnceniraci6n de enzima, lo cnal consütuye el fundamento de toda la cinética
enzimática.La wncentraci6n desustrato Muye sobrela velocidaddeforma muy
característica.A medida que la wncentraci6n de mistrato aumenta seproduce un
aumento de la velddad, pero en concentraciones muy elevadas de mistrato se
produceunestadodesaturaci6n delaenzimaquenopermitemayoresincrementas
develocidad. Para explicarestecomportamientoseempleala teoríadeMiehaellis-
Menten, según la cnal bastan 2 parámetms para explicarlo, uno, la Km definela

14. &dad dela enzimapor elsustratoyelotm,Vm esun indicador dela capacidad
cataüocade la emima
Cuandoen la reaceiónintervienen2susiratos,unodelosmpeetosmásimpor-
tantesquesedebedeterminareselordenenqueseiigsnlmsustratosyseliberanlos
productos. Atendiendoa este punto de vista se describen losmecanismos ordena-
dos, losazarowy elping pong.
La inilueneisdela mncentraeión deloswhctores essimilara la delsustrato.
La velocidad varia con elpH yexisteuna wna de pH ópümodondela veloci-
dad esla mayor. Variaciones del pH en ambaslados de esta wna determinanuna
disminución de la velocidad.
Al aumentarlatemperaturalavelocidaddereaeeiónaumenta,peropasadoun
limite comienza a disminuir, pues se producen alteraciones de la estructura
..tridimensonalde la emima.
Losactivadoresproducenun aumentodelavelddad dela reacción,sedistin-
guen2 principales,aquéliosqueseunen a la enzimalibrey losquese unen al
nishsto. Por suparte losinhibidoresdisminuyenla velocidad dela reacción, bien
porque modiñeanla Km, en cuyocasoson detipo competitivo, o por alteraciones
dela Vm,querecibenelnombredenocompetitivos.
Loseshidioseinéticmsonimportantespara elconocimientodelmeraniSrnode
a d n delasenzimas,conelpropósitode conocerloymodiñ~~rlo.Muchosmedi-
eameniosyalgunasarmasquímicassuelenserbbibidoresenzimáticosespeeífim.
Ejercicios
1.¿Cuálessonlasrazonespor lasqueen losestudioscinéticosdebesiempremedirse
velocidades iniciales?
2. Enuna experienciacinéticaseobservaqueal aumentarla concentracióndeenzima
no seproduce elesperadoaumentoproporcionaldela velocidad. ¿A quéfactores
pueden deberseestosresultados?
3. Si2enzimasactúan sobreel mismosustrato con Km de4 x 10" v7x 10." resnec-, .
tivamente¿Quéconclusionespuedenderivarsedeestosvalores?
4. Calculeelnúmeroderecambiodeuna enzimaqueal estaren una concentraciónde
10" M forma 3x 10.' M delproducto en un segundo.
5. Una enzimacatalizala reacción:
Alanina ------,Etanolamina +Co,
en un experimento realizadoa pH=8 y a 30"Cseobtienenlosdatossiguientes:
V"(pmolde CO, min-')
Calculela Kmpara la reacción

15. 6. En el estudio de la reacción:
L-aspártico -, L-ala +Co,
seencontró que el P-hidroxi-aspártico era un inhibidor de la enzima. Al tratar de
determinarqué tipo de inhibidor eraseobtuvieron losdatos siguientes:
[L-aspártico] vo(mmolde CO, min-') (mgde proteína)-'
mmol 1.'
sininhibidor con inhibidor
Constmya una gráfica de l/vuvslI[S] ydetermine de qué tipo de inhibidor setrata.