Microbiology of Brucella

3. ASPECTOS BASICOS DEL
GENERO Brucella
M.V. MSc. Datty Rosales-Zambrano
Octubre 2014
J-40013861-2

4. • Hipócrates describe en
su tratado Epidemias
algo similar a la
Brucelosis (400 A.C).
• El apóstol San Pablo
se infecto n su naufragio
en la Isla de Malta :
“Aguijón en la carne”

5. BRUCELOSIS EN EL MUNDO
• Marston, 1859.
• Bruce, 1884. Micrococcus melitensis.
• Dr. Bernard Bang. Bacillus abortus,1895.
• Comisión de Fiebre Mediterránea, 1905.
• B. suis .Traum. 1914.
• B. ovis .1953. Buddles y Boyes.
• B. canis. Carmichael (Nicoletti,2002).
DATTY R-Z.

7. Brucelosis en Venezuela
• José María Vargas. 1838.
Fiebres Malignas.
• Mosquera y Risquez. Fiebre
ondulante.1898 y 1903.
• Kubes. 1939. Observaciones
sobre la Brucelosis de los
animales domésticos en
Venezuela. Brucella abortus.
Encontrados Edo. Zulia. Cepa
19 y Reacción de Huddleson.
• Gallo y Vogelsang. 1939.
Relaciones entre la infección
brucelar de los animales y de la
Fiebre Ondulante en el hombre.
Campaña contra la Brucelosis.
• Landaeta y Ortiz,1940. Primer
caso identificado de Brucelosis
Humana en el País.
• 1941. Inicia producción cepa 19
en
• Risquez, Vogelsang y Gallo.
1943-1946. Estado actual de la
Brucelosis en Venezuela. ALTO
PORCENTAJE DE GANADO
BOVINO AGLUTINANTE A
BANG.
• Briceño Iragorry. 1949. Breve
nota sobre Brucella suis.
• De Lima, Santader,Pons y col.
1956. Consideraciones sobre
Brucelosis Bovina y Humana
en el estado Zulia.
M.V.MSc.Datty Rosales-
Zambrano. Vet.Adv.Technologies

8. Brucelosis en Venezuela
• B. abortus es la especie mas importante (Vargas, 2002).
• B. suis bv.1 ha sido descrita en capibara (Hidrochaeris
hidorchaeris ) y pecari (Tayassus tajacu).(Lord et
al.,1983 and 1991).
• Recientemente B. suis en vacuno B.taurus x B. indicus
(Rosales-Zambrano et al., 2014)
• B. melitensis, no aislada en el país.

9. Taxonomía y relaciones filogenéticas de
Brucella sp.
• Phylum: Proteobacteria (16S r)
– Clase: Alphaproteobacteria*
• Orden: Rhizobiales
– Familia: Brucellaceae
» Género: Brucella
Ochrobactrum sp
» * Rickettsias, Bartonella (Parásitos IC)
» *Agrobacterium,Rhizobium (Fitopatógenos)
DATTY R-Z.

10. DATTY R-Z.

11. DATTY R-Z.
B. papionis nov. sp 2014
B. inopinata nov. sp 2010
Brucelas atípicas
DRZ

12. DATTY R-Z.
Guzman-Berri at al., 2012
Filogenia del Genero Brucella

13. Corbel,2006

14. Especies Zoonóticas
• Especies terrestres:
• B. melitensis
• B. abortus
• B. suis
• B. canis
• Especies marinas:
• B. delphini
• B. pinnipedialis
• B. ceti

15. DATTY R-Z.

16. Características Microbiológicas del
Genero Brucella
• Cocobacilos, GRAM negativas, inmóviles, no
esporulados, aeróbicos y carboxifílicos, en
cadenas o pares (Contreras,1992; López y
col,1991 y García,1999).
• Intracelular facultativa (Schuring,1999).
• Colonias pequeñas, húmedas y brillantes,
pueden se L,R ,o M.
• Requerimientos complejos: CO2, medios
ricos, temp. 37 C°, mínimo 5 días
incubación.
• Afecta animales y hombre (López y
col,1991).
DATTY R-Z.

17. DATTY R-Z.

18. Características estructurales y
antigénicas de B. abortus.
• Membrana externa rica en: FL, LPS,y proteínas, FDC y
lípidos de ornitina con AG largos (Joklik y col,1994).
• Algo permeable a agentes hidrófobos.
• Similar a las enterobacterias (López y col,1991).
DATTY R-Z.
Tomado de Castro.2005.

19. Tomado de Castro.2005.
Estructura de la envoltura celular celular de Brucella
DATTY R-Z.

21. Factores de Virulencia
• Una vez ingerida, o internalizada las bacterias, el sistema de defensa
• insta la fusión del fagosoma con los lisosomas para formar
fagolisosomas, los orgánulos donde se localizan la mayoría de los
agentes tóxicos bactericidas.
• Las Brucellas pueden permanecer en el fagosoma intacto y bloquear
la fusión posterior con el lisosoma. Ello le protege de la acción de los
péptidos catiónicos y enzimas líticas presentes en los gránulos
lisosómicos.
DATTY R-Z.

22. DATTY R-Z

23. Factores de Virulencia
• Se cree que la cadena O (un polisacárido) y quizá lípidos de ornitina
interactuarían directamente con la membrana del fagosoma
impidiendo la fusión.
• Se sabe que la superóxido dismutasa y la catalasa, enzimas presentes
en Brucella, se integran en el mecanismo de defensa frente a la
toxicidad oxidativa.
DATTY R-Z.

24. Ingreso de Brucella al macrófago.
DATTY R-Z

25. • Las Brucellas no poseen los siguientes factores de
virulencia clásicos:
o EXOTOXINAS
o VARIACION ANTIGENICA
o ACTIVIDAD ENDOTOXICA DE LA LPS ES DE MENOR
ACTIVIDAD QUE LA DE ENTEROBACTERIAS
o PLASMIDOS O FAGOS QUE PUEDAN TRANSFERIR
GENES DE VIRULENCIA
o PILIS O FIMBRIAS PARA ADHERIR SUSTRATOS
DATTY R-Z.

26. DATTY R-Z.

27. TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS
A BRUCELOSIS ANIMAL.
DATTY R-Z.

28. TECNICAS DIAGNOSTICAS APLICADAS
A BRUCELOSIS ANIMAL.
• DIAGNOSTICO DIRECTO:
– Aislamiento y cultivo
– Diagnóstico molecular
DATTY R-Z.

29. Aislamiento en TSA
(colonias pequeñas y translúcidas)
Urea: producción de ureasa
TSI: triple azúcar hierro, Neg.
CIT:citrato de Simmons, Neg.
SIM: medio de SIM ( indol y
movilidad), Neg. todas
H2S: producción de H2S en tiras
de papel filtro con acetato de
plomo, Variable
DATTY R-Z.

30. FASE DE LA CEPA
La fase en la que se encuentran las
Colonias se determina por:
•Aglutinacion con suero anti-brucela
y acriflavina antes de proceder a
identificarla
DATTY R-Z.

31. Pruebas bioquímicas de Brucella
UREA
TSI CIT SIM
H2S
DATTY R-Z.

32. Producción de H2S
DATTY R-Z.

33. Prueba de la ureasa
DATTY R-Z.

34. Tabla diferenciación Brucella (López, 1989)
DATTY R-Z.
Especie
s
Uso CO2 Prod H2S Catalasa Oxidasa Tionina Fucsina Aglutinación
A M R Ac
B. abortus
1
2
3
4
5
6
7
8
9
+/-
+
+/-
+/-
-
-
-
+
+/-
+
+
+
+
-
+/-
+/-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
B. suis
1
2
3
4
-
-
-
-
+
+/-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
B.
melitensis
1
2
3
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
-
-
B. ovis + + + + + + - - + +
B.canis - - + + + - - - + +
B.
neotomae
- - + + - - - - - -

35. DATTY R-Z. Audic et al.,2011

36. TABLA DE FAGOTIPIFICACION EN Brucella
DATTY R-Z.
Corbel, 1989

37. Bacteriofagos de Brucella
Placas líticas
Cultivo de Brucella
sembrada con hisopo
DATTY R-Z.

38. Crecimiento en tionina 1:50,000
DATTY R-Z.

39. Crecimiento en fucsina 1:50,000
DATTY R-Z.

40. • http://www.dnalc.org/view/15924-Making-
many-copies-of-DNA.html
TECNICAS MOLECULARES EN
DX.BRUCELOSIS
Kary Mullis. Cetus Co. Calfornia. USA.1986.

41. USOS
• Taxonomía
– Aislados presuntivos
– Variabilidad fisiológica
(Cambios)
– Hospederos
• Identificación y
Diagnostico
Confirmatorio
– Alimentos
– Muestras clínicas
– Confirmación
definitiva
DATTY R-Z.

42. OMIC`S
DATTY R-Z.
Genómica Transcriptómica Proteómica
Hospedador
Especifico
Filogenia
y
Evolución
Virulencia y
Patogenicidad

43. • Octubre 2011: 39 genomas de Brucella
• Mayo 2014: 431 genomas de Brucella
(Completos o en emsamblaje)
• B. melitensis 16M (2002)
• B.suis 1330 (2002)
• B. abortus (2005)
• B. ovis y microti (2009)
• B. pinnepedialis (2011)
DATTY R-Z.

44. DATTY R-Z. Audic et al.,2011

45. TECNICAS MOLECULARES EN
DX.BRUCELOSIS
DATTY R-Z.
• Alta sensibilidad, especificidad, rápido y
económico.
• Secuencias usadas:
– IS711 (Bricker y Halling,1994)
– 16sRNA (Romero y col,1995)
– OMP31(Baily y col,1992; Streevatsan y
col,2000).
– BCSP-31 (Guarino y col,2000)
• Se pueden usar muestras clínicas: sangre
completa,suero, leche, semen, tejidos.

46. Electroforesis en agarosa al 15.% de amplificados para BCSP-
31 obtenidos a partir de sangre completa de búfalos
seropositivos a Brucella sp.
PM C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9

47. TECNICAS MOLECULARES EN
DX.BRUCELOSIS
DATTY R-Z.
• Técnicas para caracterización de cepas
y biovares:
– AMOS-PCR (Bricker y Halling,1994).
– Multiplex (García-Yoldi y col,2006)
– RFLP-PCR con IS711 (Halling y col,1993)
– Genotipificación: SNP’s (Scott y
col,2008), MLVA, MLST.

49. Ancora et al.,2005

50. PCR-Multiplex o Brucella ladder.
DATTY R-Z.
1. Brucelas marinas
2. B. melitensis
3. B. melitensis Rev1
4. B. ovis
5. B. abortus
6. B. abortus RB51
7. B. abortus S19
8. B. suis
9. B. canis
10. B. neotomae
Garcia-Yoldi et al, 2006

52. 272bp
→
587bp→
1682bp→
1071bp
→
794bp→
152bp→
1. Marcador de talla
molecula 1 kb plus de
invitrogen
2. Cepa Venezuela
3. B. suis 1330
4. B. abortus 2308
450bp→
1 2 3 4