Revisión del artículo "Caspase activation, sialidase release and changes in sialylation pattern of recombinant human erythropoietin produced by CHO cells in batch and fed-batch cultures" de Kok Hwee Chuan, Sing Fee Lim, Laurent Martin, Chee Yong Yun, Sophia O. H. Loh, Francoise Lasne y Zhiwei Song.

1. Caspase activation, sialidase release and
changes in sialylation pattern of
recombinant human erythropoietin
produced by CHO cells in batch and fed-
batch cultures
Kok Hwee Chuan, Sing Fee Lim, Laurent Martin, Chee
Yong Yun, Sophia O. H. Loh, Francoise Lasne, Zhiwei
Song.
Cytotechnology (2006) 51:67–79
Manuel García Ulloa Gámiz

2. Caspasas
Familia de proteasas
iniciadoras/ejecutoras
de la apoptosis.

3. Apoptosis vs Necrosis
Muerte celular en
biorreactores.
Necrosis
Apoptosis
(más común)
Ruptura física de la célula
por agitación/aireación
excesivas.
Falta de nutrientes, hipoxia,
acumulación de residuos,
alta osmolalidad.
Liberación de
contenidos
celulares al
medio.
Posible daño
al producto.

4. Ácido siálico
Monosacárido de 9 carbonos empleado en
la glicosilación.

5. Sialidasa

6. Objetivo
• Establecer una relación entre la activación de
caspasas, la expulsión de sialidasas y lactato
deshidrogenasa (LDH)* y los cambios en
patrones de sialilación en EPO recombinante
humana.
*Se utiliza LDH debido a su fácil
medición; de haber una correlación
fuerte entre LDH y muerte celular,
podría ser utilizada como un indicador
confiable.

7. Materiales y Métodos
• Cultivo de células CHO: batch y fed-batch.
– Biorreactores de 2 litros
– 110 rpm
– 37ºC
– 7.1 pH
• Medición de viabilidad y densidad celular: Cedex (tinción azul).
• Concentración de EPO: ELISA.
• Actividad de sialidasas y caspasas: medición de fluorescencia
emitida por sustrato artificial cada 2 mins.
• LDH: kit de detección citotóxica.
• *Caspasa-3: Western Blot.
• Detección de isoformas de EPO: enfoque isoeléctrico.

8. Resultados

9. A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch.
Punto negro: densidad celular; Círculo: viabilidad celular; Todos los demás: caspasas.
Viabilidad celular vs activación de
caspasas

10. Batch
Fed-Batch
Western Blot de Caspasa-3

11. Círculo: viabilidad celular; Triángulo: LDH; Cuadrado: sialidasa.
A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch.
Relación entre liberación de
sialidasa y LDH

12. A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch.
Círculo: viabilidad celular; Punto negro: EPO; Cuadrado: caspasa-3.
Relación entre viabilidad celular,
producción de EPO y actividad
intracelular de caspasa-3.

13. Cambios en patrones de sialilación
en la EPO
Enfoque isoléctrico.
Espectro de intensidad
de bandas AIDA 1-D.

14. Perfil de sialilación vs viabilidad
celular
Triángulo banco: sialilación en batch; Cuadrado blanco: sialilación en fed-batch;
Triángulo negro: viabilidad en batch; Cuadrado negro:viabilidad en fed-batch.

15. Conclusiones/Discusiones
• La actividad máxima de las caspasas está directamente relacionada
a la pérdida de viabilidad celular.
• Las razones de la activación de la apoptosis posiblemente son
distindas en batch y fed-batch; en fed-batch no hay carencia de
nutrientes.
• Hay correlación entre actividad de sialidasas con desialilación de
EPO recombinante humana.
• En cultivo fed-batch, la desialilación ocurrió incluso antes de que la
actividad de las sialidasas fuera considerable; existen otros factores
desconocidos.
• Aumento de LDH puede ser utilizado como indicador de apoptosis
en biorreactores.