El documento analiza los desafíos en la producción de proteínas recombinantes in vivo, destacando el estrés conformacional causado por la sobreexpresión de proteínas extrañas en células huésped. Se discuten factores ambientales como la temperatura, oxigenación, osmolaridad y pH que influyen en el plegamiento de proteínas, así como las respuestas celulares como la respuesta a proteínas desplegadas y el aumento de producción bajo condiciones controladas. Se concluye que es fundamental entender las necesidades fisiológicas de las células para mejorar la producción y calidad de las proteínas expresadas heterológicamente.

1. Manuel García Ulloa Gámiz

2. Problema
• La producción de proteínas recombinantes in
vivo es un proceso innatural para la célula
huésped.
– Síntesis de una proteína extraña.
– Cantidades inusualmente altas de producción (sesgo
metabólico = cuello de botella).
• Resultados indeseables:
– Proteínas mal plegadas / desplegadas = estrés
conformacional = baja de rendimientos / muerte
celular.

3. Estrés conformacional
• Respuesta celular
ante la acumulación
de proteínas mal
plegadas
/desplegadas.

4. Plegamiento en Eucariotas
• Lugar : Retículo Endoplásmico.
• Proteínas involucradas:
– Asistentes de plegamiento:
• Calnexina.
• HSP (heat shock proteins).
• BiP.
– Formación de puentes disulfuro:
• PDI (protein disulfide isomerases).
• Ero1.
– Control de calidad de glicoproteínas:
• UGT (UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase).
– Respuesta genética:
• Ire1.
• Hac1/hacA.

5. proteínas glicoproteínas
Unfolded
Protein
Response
ER Associated
Protein Degradation
(ubiquitinación +
proteasoma)
UGT
Sec61
translocon

6. Respuestas ante estrés
conformacional.
1.- UPR (unfolded protein
response).
2.- Atenuación traducional
(mediada por eIF2alfa).
3.- RESS (repression
under secretion stress).

7. Influencias Ambientales en
Plegamiento de Proteínas

8. Temperatura
• Expresión genética (proteínas de membrana de ER,
HSP, etc.), metabolismo.
• *Bajar la temperatura de cultivo (en general) = aumento
de productividad.
– Pichia pastoris expresando Fab humano: 1.4x.
• Hipótesis propuesta: menor temperatura = menor estrés
conformacional = mayor cantidad de producto bien
plegado.
– Además, (en levaduras) a mayor temperatura, más rigidez en la
pared celular, haciendo la secreción más difícil.
• Deben tomarse en cuenta peculiaridades de organismo
y proteína.

9. Oxigenación
• Condiciones oxidantes = estrés oxidativo:
– Acumulación de proteínas desplegadas.
• Procesos de plegamiento oxidativos (formación de puendes
disulfuro).
• *Bajar el suministro de oxígeno.
– Secreción de proteína heteróloga en P. pastoris
aumenta 2x en condiciones hipóxicas.
• *Adición de antioxidantes.
– Mitiga el estrés oxidativo en P. pastoris cultivada en
metanol.

10. Osmolaridad
• No hay conexión clara con estrés
conformacional.
– Hiperosmosis:
• Arresto temporal de ciclo celular en
Saccharomyces cerevisiae.
• Aumento de producción en células de mamífero.
• Efectos positivos en P. pastoris al expresar
fracción variable de cadena sencilla de
anticuerpos.
• Efectos negativos en P. pastoris al intentar
secretar fracción Fc de anticuerpo.

11. pH
• Depende de la proteína y la cepa utilizada.
• En general, pH bajo en cultivo produce
crecimiento lento y refuerza la pared
celular (problema si la proteína es
secretada).

12. Efectos del Estrés
Conformacional en el
Procesamiento de Proteínas

13. • BiP y PDI libres disminuyen cuando se
sobreexpresan proteínas heterólogas en S.
cerevisiae.
• BiP aumenta al expresar scFv en S. cerevisiae y
tripsinógeno humano en P. pastoris.
• Sobreexpresión de componentes ERAD en P.
pastoris.
• Activación de UPR y ERAD por expresión de:
– Activador del plasminógeno en T. reesei. y A. niger.
– Quimosina bovina en A. nidulans.
– Fragmentos de Fab y lipasa de Rhizopus oryzae en
P. pastoris.

14. Búsqueda de mitigación de estrés
conformacional
Proteínas sobreexpresadas
BiP Pdi Ero1 Hac1
Aumenta producción
en S. cerevisiae.
10x más factor de
crecimiento humano en
S. cerevisiae.
Aumento de
rendimiento en la
producción de HSA en
K. lactis.
2.4x más secreción de
alfa-amilasa de Bacillus
y 2x de invertasa en S.
cerevisiae.
Disminuye producción
en Hansenula
polymorpha al expresar
glucosa oxidasa de A.
niger .
30-60% más lisozima
humana en S.
cerevisiae.
No afecta la secreción
de EGI de T. reesei en
S. cerevisiae.
Disminuye secreción
de B-glucosidasa de
Pyrococcus furiosus en
S. cerevisiae.
Aumenta secreción de
B-glucosidasa de
Pyrococcus furiosus en
S. cerevisiae
Aumento de expresión
de Fab en S.
cerevisiae.
*Mejores resultados al
combinar con
calnexina.
Sin efecto en la
expresión de interferón
gamma en H.
polymorpha.

15. Estrés Conformacional en
Procariotas

16. • Maquinaria de plegamiento ineficiente =
baja calidad de proteína heteróloga =
mayor estrés.
• Respuesta a estrés conformacional:
– Sobrerregulación de HSP, proteasas,
chaperonas y otras cuya función es
desconocida.
– Formación de cuerpos de inclusión*.

17. *Cuerpos de Inclusión
Desventajas: fracción
insoluble = requiere
tratamiento
potencialmente
destructivo para la
proteína durante la
purificación.
Ventajas: grado de
pureza mayor.
Citoplásmicos
Periplásmicos

18. Favarecimiento de cuerpos de
inclusión con GFP
• DnaK: chaperona
bacteriana.
– Aumenta solubilidad; perjudica
el estado conformacional de
proteínas agregadas (posible
promoción de proteólisis).
– DnaK- = menor solubilidad;
mayor calidad conformacional
y rendimiento.
• **Solubiliad y calidad
conformacional son 2
propiedades divergentes.

19. Tratamiento de proteínas
contenidas en CI
• Replegamiento in vitro bajo condiciones
redox apropiadas.
• Manipulación de condiciones in vivo,
convirtiendo al citoplasma en un ambiente
oxidante.
• Secreción de proteína a periplasma
(menos reductor que citoplasma).

20. Modelos de expresión procariotas
no convencionales
• Bacillus subtilis.
– Alta capacidad de secreción.
– Producción masiva = “Respuesta de Estrés por Proteínas de
Secreción” = proteólisis de productos aberrantes.
• Pseudoalteromonas haloplanktis.
– Crecimiento acelerado incluso en altas densidades celulares.
– Transformación sencilla.
– Eficiente a bajas temperaturas (hasta 4ºC) = menor estrés
conformacional:
• Alpha-glucosidasa de levadura.
• Factor de crecimiento nervioso humano.
• Lipasas.

21. Conclusiones
• Es necesario conocer y tomar en cuenta las
necesidades fisiológicas de la célula para una
producción mayor y de mejor calidad.
• No ha sido posible crear el ambiente óptimo
para el plegamiento de proteínas.
Expresión de
proteínas
heterólogas in vivo.
Alteraciones
mayores en la
fisiología de la
célula huésped
(estrés).
Intentos por
reestablecer la
homeóstasis.