Apoyo didáctico para la clase de virología veterinaria en CUCBA U de G. Uso d ela serología en producción animal, ejemplo, porcicultura.

1. ¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS
INMUNOGLOBULINAS?
Prof. Carlos Ambrocio Ordóñez Sánchez.

2. ¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS
INMUNOGLOBULINAS?
Existen varios métodos para
estudiar las inmunoglobulinas
de membrana de los linfocitos
B que forman el receptor BcR.
Los dos mas utilizadas son:
El estudio mediante conjugados
monoclonales o policlonales
frente a los diferentes isotipos
de inmunoglobulinas, marcados
con isocianato de fluoresceína
y observados al microscopio de
fluorescencia.
El análisis por citometría de
flujo, utilizando anticuerpos
monoclonales frente a cada
isotipo de inmunoglobulina.

3. ¿CÓMO SE ESTUDIAN LAS
INMUNOGLOBULINAS?
Las inmunoglobulinas libres en suero, calostro, leche, fluidos, etc.
pueden ser estudiadas como inmunoglobulinas totales, sin
considerar frente a que antígeno reaccionan, o como anticuerpos
específicos frente a distintos antígenos de interés. Para este
último tipo de estudios, que sin duda es el más interesante, se
disponen de un gran número de técnicas que van desde las
clásicas de precipitación, fijación de complemento, etc; a las más
modernas y cada día mas utilizadas técnicas inmunoenzimaticas.
Las diferencias de sensibilidad, especificidad, capacidad de
utilización a gran escala, etc. son algunos de los conceptos
más importantes a la hora de seleccionar una u otra técnica.
Así, respecto a la sensibilidad podemos observar que hay técnicas
con niveles bajos como las de precipitación, de sensibilidad media
como las aglutinación bacteriana, fijación de complemento y
otras de sensibilidad mayor como el ELISA, la seroneutralización
o la actividad bactericida.

4. ¿Qué diferencia hay entre las
técnicas de laboratorio?
Como hemos reflejado al principio de este capítulo, hoy día existen
multitud de técnicas de laboratorio disponibles para llevar a cabo un
estudio serológico. La capacidad diagnóstica de un método, viene
determinada por el cálculo de la sensibilidad y especificidad de ese
determinado método, frente a la técnica considerada de referencia.
Hay algunos conceptos que convienen recordar para saber valorar cada
una de las técnicas disponibles. Estos conceptos son:
Sensibilidad: Es la capacidad de un método para detectar sueros
positivos frente a una determinada enfermedad. La sensibilidad
permite que todos los positivos sean detectados.
Especificidad: Es la capacidad de un método para diferenciar sueros
positivos de los sueros negativos en una determinada enfermedad. La
especificidad evita dar resultados falsos positivos. Ningún negativo
debe ser considerado por la técnica como positivo.

5. ¿Qué diferencia hay entre las
técnicas de laboratorio?
Valor predictivo: Es la capacidad de una técnica para distinguir entre
animales que están padeciendo una determinada enfermedad de los que no
la están padeciendo. En definitiva, predecir la sensibilidad y especificidad
para un caso negativo o para un caso positivo. El valor predictivo puede
ser:
Positivo: Es la frecuencia de la enfermedad entre los animales con resultado
positivo.
Negativo: Es la frecuencia de ausencia de la enfermedad en los animales
con resultado negativo.
Eficacia: Porcentaje de animales clasificados correctamente con un método
determinado.
Positivo verdadero: Animal enfermo correctamente clasificado por la
técnica.
Positivo falso: Animal incorrectamente clasificado por la técnica empleada.

6. Sensibilidad de las diferentes técnicas para la detección de
anticuerpos (mg/ml)
MÉTODO SENSIBILIDAD (µg/ml)
Precipitación en gel 30
Precipitación en anillo 18
Aglutinación bacteriana 0,05
Fijación de complemento 0,05
Hemaglutinación pasiva 0,01
Inhibición de la
hemaglutinación
0,005
Inmunofluorescencia 0,005
ELISA 0,0005
Neutralización bacteriana 0,00005

7. ELISA, anticuerpos marcados con
una enzima
El ELISA, se basa en el uso de
anticuerpos marcados con una enzima
(generalmente la peroxidasa), de forma
que los conjugados resultantes tengan
actividad tanto inmunológica como
enzimática.
Al estar uno de los componentes
(antígeno ó anticuerpo)
insolubilizados sobre la placa, la
reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y por tanto,
podrán fácilmente ser revelada
mediante la adición del sustrato, que
al actuar sobre la enzima, producirá un
color observable a simple vista o
cuantificable mediante un colorímetro.
Existen bastantes KITS comerciales
disponibles y por tanto pueden
realizarse estudios serológicos sin
necesidad de grandes medios.

8. ELISA INDIRECTO
Es el método más utilizado para la
determinación de anticuerpos.
Básicamente, consiste en la
inmovilización a la placa de ELISA
del antígeno (en los Kits ya viene
fijado) del que queremos conocer si en
el suero problema existen anticuerpos
específicos. Se pueden utilizar como
antígenos, proteínas virales o
bacterianas e incluso virus completos.
Cada día es más frecuente utilizar
exclusivamente las proteínas de
interés inmunológico y no todas las
proteínas antigénicas. Los pasos
siguientes serian la adición del
suero problema, incubación y
lavado, adición del conjugado,
incubación y lavado, finalizando con
la adición del sustrato, el frenado de
la reacción y la lectura.

9. ELISA DE COMPETICIÓN
En este sistema también es muy
utilizado para la detección de
anticuerpos específicos. Se parte
de un anticuerpo (monoclonal o
policlonal), frente a un antígeno
conocido, que previamente ha
sido inmovilizado en la placa. Se
denomina de competición ya
que el suero problema es
incubado previamente con el
antígeno, antes de incubarlo
con el antisuero fijado en la
placa, y por tanto compite con
él.
Los pasos siguientes es la adición
e incubación del conjugado,
lavado y finalización con el
sustrato y lectura.

10. INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
O WESTERBLOT
La
inmunoelectrotransferencia
"westerblot" o
"Immunoblotting" es una
técnica inmunoenzimática
que se utiliza para la
detección de anticuerpos
especificos. Se recomienda
cuando no hay que estudiar
un gran número de sueros
o para analizar sueros
dudosos por otras
técnicas. Este método utiliza
como soporte antigénico
filtros de nitrocelulosa, donde
las proteínas del antígeno
han sido previamente
transferidas, manteniendo
total o parcialmente sus
propiedades antigénicas.

11. LA INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA O INMUNOPEROXIDASA
La inmunofluorescencia indirecta o la
inmunoperoxidasa, según se utilice el
isocianato de fluoresceína o la peroxidasa,
son técnicas que utilizan la especificidad
de la histología (pueden ver la célula y
comprobar que la reacción inmunológica
se produce en un sitio especifico) con la
sensibilidad de las técnicas
inmunológicas.
Estas técnicas utilizan normalmente cultivos
celulares (primarios o de líneas estables)
infectados con el virus o la bacteria sobre la
que se desea comprobar si hay o no
anticuerpos en el suero problema. Tras la
incubación con el suero problema; si hay
anticuerpos se unirán a las células infectadas
pero no a las no infectadas (especificidad
histológica observable). La unión se visualiza
tras la adición de un conjugado anti-
inmunoglobulina marcado con isocianato o
con peroxidasa y la posterior observación al
microscopio de fluorescencia o convencional
respectivamente.

12. SERONEUTRALIZACIÓN
Este método está considerado de
referencia para cualquier estudio
serológico pues es el que más se
correlaciona entre la respuesta "in vitro" y
la respuesta "in vivo". En esta prueba se
puede valorar la capacidad que tienen los
anticuerpos presentes en un suero problema
para neutralizar la actividad biológica de un
antígeno.
Los métodos descritos hasta ahora permiten
valorar la capacidad que un suero
determinado tiene para reconocer un antígeno
concreto, en la seroneutralización se avanza
un paso más y se indica la capacidad que
tiene un suero para neutralizar la actividad
biológica del antígeno. Estos métodos son
ampliamente utilizados en los laboratorios
para valorar la capacidad de un suero
frente a toxinas bacterianas, bacteria y/o
virus. Estas pruebas son más laboriosas,
requieren de cultivos celulares, esterilidad,
además de ser generalmente más lentas que
todas las anteriores. Sin embargo son
altamente especificas y sensibles, y se
consideran las pruebas de referencia para
cualquier valoración serológica.

13. Los seroperfiles
Los seroperfiles se basan en la detección de los
anticuerpos circulantes mediante cualquiera de las
técnicas actualmente disponibles, con el fin de poder
obtener información sobre la situación del animal en
ese momento, o en estados previos. Estos estudios son
cada día más utilizados para el control sanitario de las
explotaciones porcinas, representando en muchos
casos un importante medio para reducir costes y
aumentar el nivel sanitario.
Los análisis serológicos permiten, entre otras posibilidades:
conocer la situación sanitaria, elegir el mejor momento
para vacunar, controlar los programas vacunales y
evitar la entrada de enfermedades en la explotación.

14. ¿Qué deseo conocer de mi explotación?
La serología nos puede ayudar para
conocer algunas cosas, pero no para
otras. Es importante conocer estas
limitaciones. La dinámica de aparición de
los anticuerpos, la dificultad para
diferenciar anticuerpos vacunales de
anticuerpos de enfermedad, el tiempo que
tardan los anticuerpos en aparecer tras
una infección, etc. son algunas
consideraciones que debemos siempre
recordar al planificar el estudio serológico.

15. ¿A qué animales y en qué momento les debo
preguntar?
Esta es otra pregunta importante que debemos
tener definida. Recordar que los animales de las
distintas fases de producción pueden
presentar diferentes seroperfiles; luego
debemos preguntar a los animales que puedan
contestar a nuestra pregunta. Como ejemplo,
debe recordarse que las inmunoglobulinas no
atraviesan la placenta, por lo que el lechón no
presenta inmunoglobulinas hasta que tome el
calostro materno.

16. ¿Qué número de muestras son necesarias para un estudio serológico?
Esta es otra de las preguntas clave para que los resultados sean
significativos de la situación. Además, de tomar muestras de las diferentes
zonas de la explotación y de las diferentes áreas productivas, es también
importante definir cuantas muestras necesitaré de cada zona. Dos
aspectos son importantes a la hora de evaluar una explotación porcina:
Aquellos encaminados a conocer si existe o no una determinada
enfermedad en la explotación y los estudios que en caso afirmativo,
pretenden conocer su prevalencia. En otras palabras las preguntas
serían: ¿Existe tal o cual enfermedad en mi explotación? En caso
afirmativo ¿Cuál es su prevalencia?. Para contestar a una u otra
pregunta es vital determinar el tamaño de la muestra que debemos
analizar. Este tamaño de muestra también dependerá del grado de
precisión que deseemos obtener. Para estos estudios existen tablas (ver
otras fuentes de información) que indican el número de muestras que
necesitamos en función de la prevalencia esperada, la precisión y el nivel
de confianza deseado. El número de muestras necesarias varía mucho
dependiendo del nivel de confianza que deseemos obtener y la
prevalencia que sospechemos.

17. En general, desde un punto de vista práctico y sencillo, se pueden
aplicar las siguientes cifras para un muestreo serológico:
Para reproductoras:
En explotaciones con menos de 25 animales: Se estudiaran todos
En explotaciones entre 25 y 100 reproductoras: Se tomaran 25
muestras que en las siguientes determinaciones irán rotando.
En explotaciones con mas de 100 reproductoras: 30 muestras y se
rotarán.
En cebo:
Al menos 30 muestras por cada área de cebo.
La otra pregunta sería: ¿qué tipo de muestra necesito y como
tomarla?. Los seroperfiles se llevan a cabo fundamentalmente a partir
del suero de los animales, aunque a veces también interesa conocer la
cantidad de inmunoglobulinas presentes en el calostro y/o en la leche
materna. Las muestras de calostro se debe recoger durante las 24
horas después del parto. Si se va a remitir a laboratorio de forma
inmediata conviene refrigerarlo y enviarlo con refrigerante. Si el envió se
realizará en los días siguientes se debe congelar y enviar posteriormente
bajo refrigeración.

18. ¿Qué hago con la sangre una vez extraída?.
Por último, ¿Qué hago con la sangre una vez extraída?.
La sangre debe quedar a temperatura ambiente (en una
sombra, en zona fresca) hasta su coagulación
(aproximadamente entre una y dos horas), después debe
mantenerse a + 4º C (frigorífico) toda la noche.
Posteriormente, es aconsejable centrifugarla o al menos
separar el suero del coagulo antes de su envío al
laboratorio. Los tubos deben ir claramente marcados y
empaquetados. Si el estudio que se desee llevar a cabo
implica la realización de dos determinaciones con un
intervalo de 21 días (seroconversión) sería mejor congelar el
suero una vez coagulado y separado del coagulo y esperar
a la siguiente toma para hacer la misma operación y enviar
ambos sueros a la vez. Un buen diagnóstico depende en
gran medida de una buena muestra. Evitar
contaminaciones o alteraciones del suero siempre es
una garantía para el diagnóstico.

19. ¿QUÉ APLICACIONES PRÁCTICAS
PRESENTAN LOS SEROPERFILES?
Prevenir la entrada de enfermedades en los animales de reposición.
El conocimiento serológico de la explotación origen es recomendado, así
como la realización de un periodo de cuarentena entre 4 a 8 semanas,
según la enfermedad que queramos controlar. Conviene recordar que cada
enfermedad infecciosa tiene un periodo de incubación y otro de eliminación que
varía considerablemente.
Elegir el momento de vacunación más adecuado en la explotación.
Es fundamental conocer cuando los anticuerpos maternales presentan niveles
bajos (no protectivos) para adelantarnos en la administración de la vacuna.
Hacer seguimientos de los programas vacunales, así como conocer el
estado sanitario de la explotación.
Hay que recordar que los perfiles serológicos sirven para conocer la
situación sanitaria en las condiciones productivas del estudio. Si alguno de
esos parámetros cambiara (distinta vacuna, edad de vacunación, diferentes
animales, etc), también podría cambiar el resultado de los perfiles, por lo que
habría que realizar los estudios serológicos cada vez que se realicen cambios
en la explotación.