El documento describe un laboratorio de microbiología que adiestra a los estudiantes en la inoculación de embriones de pollo y analiza el efecto citopático de los virus en cultivos celulares. Detalla las técnicas de propagación de virus, incluyendo el uso de animales de experimentación y cultivos celulares, así como los distintos tipos de cultivos y sus características. Se enfatiza la importancia de estos métodos para estudiar la oncogénesis viral y la patología de las enfermedades virales.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZALaboratorio de Microbiología General IIEmbrión de PolloINTEGRANTESLuis Islas JorgeMartínez Rojas Hugo Ponce de León VeazNoemiVargas Cisneros BereniceVargas Olvera MireyaEquipo 3, 2752

2. OBJETIVOSAdiestrar al alumno en el manejo de la técnica inoculación de embrión de pollo por las vías más utilizadas.

3. El alumno conocerá las diversas partes del embrión de pollo de 9 días de inoculación. Efecto Citopático

4. Efecto citopáticoSe denomina efecto citopático a los cambios bioquímicos y moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía óptica, causados durante el ciclo de replicación viral.Aunque todos los virus líticos producen efecto citopático, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones

5. Efecto citopáticoLa mayor parte de las observaciones del ECP se han realizado en células infectadas en cultivo, en las que se aprecia: pérdida de adherencia al sustrato, inhibición por contacto, redondeamiento celular, formación de sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos, transformación celular, lisis, etc.

6. LisisEs la conclusión del conjunto de alteraciones celulares que se producen, secuencial o simultáneamente en la célula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partículas virales.

7. Cuerpos de inclusiónMuchos tipos de virus inducen la aparición de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmáticas o pequeñas.

8. SinciciosLos sincicios son grupos de células fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada

9. Transformación celularEs una alteración en el crecimiento normal de las células en cultivo con evidentes manifestaciones morfológicas. Se asocia a una serie de cambio moleculares y está especialmente ligada a virus que insertan su genoma en el de la célula infectada, pudiendo causar mutagénesis insercional al interrumpir antioncogenes o activar pro-oncogenes, o alterando la correcta regulación de la expresión génica celular.

10. Alteraciones bioquímicasLas alteraciones bioquímicas son muy diversas y específicas de cada virus, si bien pueden señalarse las más importantes a nivel general.Algunos virus son capaces de mostrar esta inhibición en etapas tempranas de la infección pero la mayoría de los virus animales lo hacen en etapas tardías. El efecto más drástico suele producirse en la inhibición de la expresión de proteínas celulares por traducción preferente o casi exclusiva de proteínas virales.

11. Alteraciones bioquimicas1.- Inhibición de la síntesis de proteínas celulares2.- Inhibición de la síntesis de DNA celular3.- Inhibición de la síntesis de RNA celular

12. Alteraciones de las membranas celularesCambios en la actividad de enzimas presentes en las membranas. Modificaciones en la funcionalidad del sistema vesicular. Aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática.

13. Técnicas de Cultivo

14. Técnicas para el cultivo de virusLos sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:1.Animales de experimentación2.Embriones animales3.Cultivos celulares artificiales

15. Animales de experimentaciónLa inoculación en animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su aislamiento o propagación.

16. Poco usada

17. Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros sistemas no es posible.

18. Los animales más utilizados: monos, los cobayos y los ratoneslactantes

19. Embriones de animales Los más utilizados son los embriones de pollo

20. los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días.

21. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión (cavidad amniótica, saco vitelinol etc.).Cultivos celularesSe cultivan células de mamífero en una sola capa (monocapa) sobre la superficie de un recipiente de plástico y son inoculadas con la muestra estudiada.Después se observan a diario los cambios inducidos por virus (efectos citopáticos), a veces tan característicos que no se requiere de más investigación para informarlos, sin embargo, a menudo son necesarias algunas pruebas confirmativas, como inmunofluorescencia.

22. Tipos de cultivos celularesLíneas celulares semicontinuas : Estas células derivan de tejido fetal humano o animal. Poseen el cariotipo diplode normal y, por tanto, es posible utilizarlas en la producción de vacunas. Tienen un periodo de vida limitado y sólo es posible hacer subcultivos de unas 50 generaciones.

23. Líneas celulares continuas: Las más utilizadas para el diagnostico. Derivan de un tumor o de células normales que, después de cultivos repetidos, se transforman tanto que actúan como células derivadas de tumor, es decir, poseen un número anormal de cromosomas, Estas células pueden propagarse de manera indefinida.

24. Cultivos de linfocitos: Los linfocitos B se dividen y continúan la división de manera indefinida cuando están infectados por VEB. Esta característica es conocida como inmortalización y se puede aprovechar como marcador del aislamiento de VEB.Los linfocitos T crecen en presencia de una linfocina, IL-2, el descubrimiento de este fenómeno ha sido fundamental para el estudio de los retrovirus humanos (VIH y HTLV) que logran propagarse en cultivos celulares con la formación de células gigantes sincitiales.

26. Importancia La inoculación animal sigue siendo un método de gran valor para estudiar: La oncogénesis viral La patología de los padecimientos virales La respuesta inmune a los virus El efecto de los factores ambientales sobre infecciones virales

27. Cuerpo de Negri.Corpúsculos hallados por Negri en las células del sistema nervioso central de los animales muertos de rabia; son específicos de esta enfermedad. Se trata de reacciones de la célula contra el virus. No se hallan en los animales inoculados con la rabia experimental.

28. Cuerpos de Negri por RabdovirusEl virus de la Rabia en el cerebro de animales infectados produce Cuerpos de Negri de varias formas (menores de 1 micrómetro de diámetro, con masas redondas u ovales, y cintas de 2 a 10 micras de diámetro). Estos son inclusiones eosinofílicas intracitoplasmáticas formadas por agregados de nucleocápside en las neuronas de cerca de 50 a 80% de los humanos infectados.

29. Histopatología de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri característicos están presentes con una célula de Purkinje del cerebelo en este paciente que falleció por rabiaHistopatología de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri característicos están presentes con una célula de Purkinje del cerebelo en este paciente que falleció por rabiaVVV

32. Embrión de Pollo

33. EMBRIÓN DE POLLOSe reconoce el embrión que esta vivo porque en la transiluminación se ven como telaraña venas que forman la membrana corioalantoidea y se observa que se desplaza un punto negro intermitente (el ojo).

34. EMBRIÓN DE POLLOAl morir, los vasos se desintegran y este yace fijo al polo superior del huevo. A medida que aumenta de tamaño disminuye el volumen de los líquidos extraembrionarios

35. CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADOUTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo conveniente y fácil de manipular que se utiliza en la propagación, titulación e identificación de virus, así como en la preparación de algunas vacunas virales.Se emplean huevos con 5 a 14 días de incubación, según la vía de inoculación:Membrana corioalantoideaCavidades alantoidea y amniótica Saco vitelinoIntracerebralEndovenosa.

36. TIPOS DE VIRUS QUE SE PUEDEN INOCULAR EN EMBRION DE POLLO

37. Embrión de pollo

38. EMBRIÓN DE POLLO

39. Vías de InoculaciónSelectividad que tienen algunos virus por determinados tejidos

40. Inoculación por saco alantoideoCon colorante se observa: liquido alantoideo, albumina y cámara de aire teñidosLiquido alantoideo: virus hemaglutinantes o producción de hemaglutininasEmbrión de 9-12 días, inoculo de 0.1-0.2ml

41. Inoculación por saco alantoideo

42. Inoculación en saco amniótico Con colorante: líquido amniótico, cámara de airePrimoaislamiento de cepas de influenzaEmbrión de 7-15 días, inoculo de 0.1-0.2ml

43. Inoculación en saco amniótico

44. Inoculación en saco vitelino Con colorante: Saco vitelino, Cámara de aireCultivo de clamidias y ricketsiasEmbriones de 5-8días, inoculo de 0.2-1ml

45. Inoculación en saco vitelino

46. Inoculación de membrana corioalantoidea (MCA)Con colorante: membrana corioalantoideaPermite cuantificar aquellos grupos virales que producen lesiones localizadasEmbrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-0.5ml

47. Inoculación de membrana corioalantoidea (MCA)

48. Embrión de polloLa infección puede producir una lesión tisular local conocida como pústula (característico de virus) A veces se inyecta el virus directamente en el embrión en desarrollo: IV, intraperitoneal, o intracerebral.Tambien influye: la dilución, la cantidad del inóculo, la temperatura y tiempo de incubación tras la inoculación

51. Metodología

52. Metodología