Este documento describe los procedimientos para una práctica de espectrofotometría. Incluye instrucciones para construir una curva de calibración usando soluciones estándar de bicromato de potasio y determinar la concentración de una solución desconocida mediante la curva o el factor de calibración. Explica conceptos clave como absorbancia, leyes de Beer-Lambert y uso del espectrofotómetro.

1. ASOCIACION
UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
SEMESTRE ACADEMICO 2013-II
CURSO: BIOQUIMICA Y NUTRICION
PRACTICA Nº 1
ESPECTROFOTOMETRIA

2. OBJETIVOS:
• Construir una curva estándar o de calibración del
Bicromato de potasio 40mg%
• Determinar la concentración de una solución de
bicromato de potasio de concentración desconocida
haciendo uso de la curva de calibración
• Determinar la concentración de una solución de
bicromato de potasio de concentración desconocida
haciendo uso del Factor de calibración

4. Se le llama espectrofotometría a la medición
de la cantidad de energía radiante que absorbe
un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro, en función de la longitud de onda
de la radiación lumínica y a las mediciones a
una determinada longitud de onda.
* Arco iris en Marte

5. ***
Así todos los elementos existentes poseen un
espectro

8. La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de onda
(λ = lambda).
λ

9. La luz visible es
sólo una pequeña
parte del espectro
electromagnético
con longitudes de
onda que van
aproximadamente
de 350 nanómetros
hasta unos 750
nanómetros
<nanómetro, nm =
milmillonésimas de metro>.
L
u
z
v
i
s
i
b
l
e
350 nm
750 nm
GAMMA
X
U.V.
Infrarrojo
Microondas
Radio

11. La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo
de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda

12. El color de un cuerpo depende de la luz que
recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el
color rojo se dá cuando absorbe en casi su
totalidad, todas las radiaciones menos las
rojas, las cuales refleja o deja pasar
dependiendo su estructura (sólida o
transparente).

13. Luz incidente (I0) Luz absorbida Luz emergente (I)
Longitud del medio
absorbente o ancho de la
celda
I0
c = concentración.
(número de partículas por
cm3)
I
a = absortividad
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0
pasa a través de una solución, parte de la luz es absorbida
resultando que la luz emergente I es menor que I0
b
a

14. Las leyes de Lambert y Beer *

15. Ley de Lambert: cuando un rayo de luz
monocromática (I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la longitud del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ab
1 cm. 2 cm. 3 cm.
I0 I I0 I0
I I
Ancho de la celda

16. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromática pasa a
través de un medio absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente a medida que la concentración del medio
absorbente aumenta
I = I0e-ac
I0 I0 I0I I I

17. Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley
de Beer-Lambert donde la fracción de luz incidente que es
absorbida por una solución es proporcional a la concentración
de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (Io) y la reflejada (I) dará
una idea de la cantidad de radiación que ha sido absorbida
por la muestra.

18. I0 I
LUZ
A
B
S
O
R
B
I
D
A
Luz transmitida
De acuerdo a las características de la sustancia
analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución
T = I/I0

19. Por lo tanto la absorbancia es reciproca de
la transmitancia
Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo
negativo y comportamiento exponencial)
Concentración
Absorbancia
Concentración
% Transmitancia

20. La representación gráfica correspondiente a
absorbancia y transmitancia en un gradiente de
concentraciones es la siguiente:
Concen
tración

22. Un espectrofotómetro es un instrumento
que descompone un haz de luz (haz de
radiación electromagnético), separándolo
en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro,
semejante a un código de barras del
objeto, con el propósito de identificar,
calificar y cuantificar su energía

23. DISTRIBUCIÓN DE LA LUZ EN EL
ESPECTROFOTÓMETRO

24. Espectrofotómetro Mecanismo Interno

25. ¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)
compuestos parecidos pero diferentes?
Para la determinación de la concentración de un
compuesto en particular se indica una longitud de
onda (l) específica a la que hay que leer con el
colorímetro o espectrofotómetro.
La explicación radica en el hecho de que cada
producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

26. Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

27. celda de 5uL
La muestra se coloca en una cubeta* de
forma prismática

28. Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual
se vierte la solución a leer no debe desviar la
trayectoria de la luz como requisito para el
cumplimiento de la ley de Beer

29. Como el cuarzo aparte de ser muy transparente presenta un
comportamiento constante ante la variación de la longitud de
onda es común que las celdas del espectrofotómetro o
colorímetro sean de este material .

30. El razonamiento para el proceso de
determinación de una concentración
desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las
cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la
concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)
Curva Patrón

32. CURVA PATRÓN
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 2 4 6 8 10 12
Concentración mg/lt
A
B
S
0
R
B
A
N
C
I
A
Interpolación
Absorbancia del problema

33. Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con
la concentración, se comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:
Abs MP / Abs estándar = Conc. MP / Conc. Estándar
Conc estándar x Abs problema
Conc. M P =
Abs estándar
FC = Conc estándar
Abs estándar

34. En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la
preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se
incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0)
contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin
de poder calibrar la absorvancia del equipo a cero
Compuesto 1
(blanco)
2 3 4 5 6 7
Glucosa 0,1 mg/ml
(mL)
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Agua destilada
(mL)
1.0 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0
Fenol al 5% (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Acido sulfúrico
(mL)
5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

35. Tubos Absorbancia
1 0
2 0.135
3 0.253
4 0.417
5 0.658
6 0.574
7 0.768
Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm
RESULTADO de la curva patrón anterior
Curva de calibración de glucosa
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1 2 3 4 5 6 7
Tubos
Absorbancia

36. Spectronic 20 D Spectrónic 20

37. EXPERIMENTO:
TUBO I TUBO II TUBO III TUBO IV
Bicromato de potasio 40mg% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml
Agua destilada 9 ml 8 ml 7 ml 6 ml
Concentración mg% 4 mg%
Absorvancia
Mezclar por inversión y leer en el espectrofotómetro a 530nm
a) Construir su curva de calibración en papel milimetrado
b) Medir la absorbancia de la MP que el profesor le hará entrega
c) Obtener el FC promedio de las soluciones estándar
d) Calcular la Concentración de la MP:
a) Extrapolando
b) Usando el FC