Este documento presenta un experimento sobre espectrofotometría. El objetivo era conocer cómo usar un espectrofotómetro y analizar datos. Se midió la absorbancia de varias soluciones a diferentes longitudes de onda y concentraciones. Los resultados se graficaron y ajustaron con la ley de Beer-Lambert para determinar las concentraciones óptimas.

1. PRÁCTICA N°01
ESPECTROFOTOMETRÍA
INTRODUCIÓN
La espectrofotometría puede definirse como la medida de la atenuación que la
muestra efectúa sobre una radicación incidente sobre el mismo con un espectro
definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido
entre 220 y 800nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias
zonas: la zona de la radiación visible, situada por encima de 380nm, y la zona de
la radiación ultravioleta situada por debajo de estos 380nm. La región del infrarrojo
se sitúa por encima de los 800nm.
La espectrofotometría también se puede definir como la medición de la cantidad
de energía radiante que absorbe o transmite un sistema químico en función de la
longitud de onda; es el método de análisis óptico más usado en las
investigaciones químicas y bioquímicas. El espectrofotómetro es un instrumento
que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que
contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia.
La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de
cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda está
asociada con los fotones, cada uno de los cuales posee una cantidad definida de
energía.
En esta práctica se tiene como objetivo el conocer cómo usar el espectrofotómetro
y como utilizar los datos que este arroja. El análisis cuantitativo por espectroscopia
de absorción mide la absorbancia de una sustancia a varias longitudes de onda
crecientes. Después al graficar el dato de absorbancia contra el de concentración
se obtuvo una curva que recibe el nombre de gráfica de la ley de Beer y Lambert.

2. OBJETIVOS
 Obtener el coeficiente de absorbancia de la sustancia problema
 Determinar la longitud de onda adecuada y los niveles de concentración
para el análisis cuantitativo por espectrometría.
MATERIALES
- Tubos de ensayos
- Solución de (K2CrO4), (Cu2SO4) y (KMNO4)
- Agua destilada
- Espectrofotómetro
MARCO TEÓRICO
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas que
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida dependen de forma lineal de la concentración. Además es usada para
identificar compuestos por su espectro de absorción y conocer la concentración de
un material o sustancia, esto último permite, seguir el curso de reacciones
químicas y enzimáticas así como determinar enzimas y proteínas incluso ácidos
nucleicos.
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, como ya
sabemos es un equipo de laboratorio que mide la cantidad de luz que pasa por

3. medio de una longitud de onda especifica. La cantidad de luz absorbida por un
medio es proporcional a la concentración del soluto presente, es entonces así que
la concentración de un soluto colorido en solución puede ser determinada en el
laboratorio mediante la medición de su absorción de luz a una longitud de onda
específica.
Las muestras en estos equipos se utilizan en estado líquido y se colocan en el
compartimiento de las muestras de celdas transparentes de diferentes tamaños y
materiales.
En espectroscopia el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación
electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400nm) y el visible (400-780nm).
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400nm. Es
una región de energía muy alta.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que
corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la longitud
de onda en la que absorbe luz la solución coloreada.
La fuente de radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energía por debajo de 320nm.
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad
de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra y l a
absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos
indica la cantidad de luz absorbida por la misma.

4. Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración a
mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará;
y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo
PROCEDIMIENTO
Agregar a cada tubo de
ensayo la cantidad de
reactivo indicado.

5. Tenemos los tubos
numerados y solos con el
reactivo a utilizar.
Agregamos agua destilada
para igualar la cantidad en
cada solución
Llevamos cada grupo de
soluciones al
espectrofotómetro para
determinar su
absorbancia
Anotamos los datos
obtenidos para
posteriormente
realizar los gráficos
correspondientes

6. RESULTADOS
Tubos I II III IV V
KMNO4
0 1 2 3 4
(0.015%)
Agua
Destilada
4 3 2 1 0
Mezclar - Leer a 475 nm
Concentración 0 150 300 450 600
Absorbancia 0 0.189 0.385 0.577 0.746
C= fc * Do
CuSO4 (10%)
Concentración 0 100 200 300 400
Absorbancia 0 0.094 0.176 0.272 0.351
KCrO2 (0.1%)
Concentración 0 1 2 3 4
Absorbancia 0 0.066 0.15 0.228 0.317

7. GRÁFICOS
KMNO4 (0.015%)
y = 0.0013x + 0.0034
R² = 0.9994
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Absorbancia
Linear (Absorbancia)

8. CuSO4 (10%)
y = 0.0009x + 0.0026
R² = 0.9991
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Absorbancia
Linear (Absorbancia)

9. KCrO2 (0.1%)
y = 0.0796x - 0.007
R² = 0.9977
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
-0.05
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Absorbancia
Linear (Absorbancia)

10. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál crees que es el método más exacto para obtener la concentración de
una muestra problema, el gráfico o el analítico?
¿Por qué?
El analítico, ya que es un instrumento especializado para el análisis
químico que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación
entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a radiaciones y
la concentración o reacciones químicas que se miden en una muestra.
2. ¿Qué factores alteran la ley de LAMBERT y BEER?
La ley de Beer-Lambert sólo se cumple para concentraciones bajas, a partir
de una concentración 0,01M empieza a haber desviaciones de la linearidad.
Además, si la radiación utilizada no es monocromática, también puede
haber errores.
La existencia de otros equilibios químicos en disolución, como ácido-base,
de precipitación, de formación de complejos, aunque no modifican la ley en
sí misma, sí que pueden modificar la concentración de la sustancia que
estamos midiendo, y puede producir un error en el resultado.
3. ¿Existe otro método de ajuste de curvas?
- Rectas de Regresión en mínimos cuadrados
- El ajuste potencial y=AxM
- El ajuste exponencial y= CeAx
- Combinaciones lineales en mínimos cuadrados

11. 4. ¿Cuál es el objetivo de utilizar el método de los mínimos cuadrados?
Mínimos cuadrados es una técnica de análisis numérico enmarcada dentro
de la optimización matemática, en la que, dados un conjunto de pares
ordenados: variable independiente, variable dependiente, y una familia de
funciones, se intenta encontrar la función continua, dentro de dicha familia,
que mejor se aproxime a los datos (un "mejor ajuste"), de acuerdo con el
criterio de mínimo error cuadrático.
5. Mencione aplicaciones de la práctica en el campo de su especialidad
La aplicación de diversos métodos matemáticos al cálculo de
concentraciones y otras propiedades a partir de datos instrumentales se
conoce como quimiometría y es un área de intensa actividad, sus
aplicaciones en la agroindustria son para procesos químicos y/o físicos, y
en estudios ambientales en general como por ejemplo la predicción de
propiedades de carbones minerales a partir de datos del infrarrojo medio,
con el objetivo de desarrollar métodos de análisis rápidos y no destructivos
para estos materiales.
Otro ejemplo sería cuando un ingeniero agroindustrial de una embotelladora
está analizando la entrega de producto y el servicio requerido por un
operador de ruta para surtir y dar mantenimiento a máquinas
dispensadoras. El ingeniero visita x locales al azar con máquinas
dispensadoras, observando el tiempo de entrega en minutos y el volumen
de producto surtido en cada uno. Las observaciones se grafican en un
diagrama de dispersión (no todos los puntos están contenidos en una
recta), donde claramente se observa que hay una relación entre el tiempo
de entrega y el volumen surtido; los puntos casi se encuentran sobre una
línea recta, con un pequeño error de ajuste, para lo cual aplicaremos el
método de los mínimos cuadrados.

12. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES
1. Debido a que no fuimos muy exactos, utilizamos el método de mínimos
cuadrados para poder ajustar la recta de la absorbancia.
2. Se identificó que el equipo presenta una adecuada precisión y exactitud
determinando que las mediciones realizadas en este pueden ser confiables.
3. El conocer el adecuado uso del espectrofotómetro permitió obtener en el
laboratorio resultados con alta calidad analítica en las mediciones que son
emitidas por éste.
4. Se determinó la longitud de onda óptima a las tres soluciones coloreadas
teniendo como resultados las siguientes: solución amarilla 625 nm, para
solución de color celeste 600, y para la solución de color fucsia una longitud
de onda de 475nm, concluyendo que los datos obtenidos experimentalmente,
se encuentran dentro de los datos teóricos.
BIBLIOGRAFÍA
1. Walton y Reyes. 1978. Análisis químico e instrumental moderno. Editorial
Reverte S.A. España.
2. Borfost R. y Scholz, M.1964. Spektroskopische Methoden in der organischen.
Chemie. Berlin.
3. Sánchez, D.1995. instrumentación en Bioquímica. Consejo nacional de
Ciencia y Tecnologia (CONCYTEC). Lima.
LINKOGRAFÍA
1. http://www.academia.edu/4264776/FOTOCOLORIMETRIA_carlos_lavarez
2. http://www.slideshare.net/kelycaterine/espectrofotometro-28574184

13. “Año de la Promoción de la Industria Responsable y del Compromiso
Climático”
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE AGROINDUSTRIA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL: INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
CURSO: BIOQUÍMICA
III CICLO
DOCENTE:
BLG. ETERIO ALVA MUÑOZ
ALUNMA:
CABALLERO BURGOS MÉLANHY
GRUPO: B
NUEVO CHIMBOTE- junio de 2014