Este documento describe el procedimiento para realizar un recuento de coliformes totales en muestras de agua utilizando la técnica de filtración a través de membrana. La técnica implica filtrar la muestra de agua a través de una membrana de 0,45 μm y cultivar la membrana en agar Endo para identificar las colonias de coliformes totales luego de 24 horas de incubación. El número de colonias se cuenta y se expresa como unidades formadoras de colonias por 100 mL de muestra de agua original. El documento también discute factores

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LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA
DE MICROORGANISMOS
PRACTICA # 10
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PRACTICA # 10 MICROBIOLOGIA DEL AGUA
Recuento de Coliformes Totales Filtración a través de membrana
1. INTRODUCCIÓN
Los coliformes totales son las Enterobacteriaceae lactosa-positivas y constituyen un grupo de
bacterias que se definen más por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios
taxonómicos. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para
fermentar la lactosa con producción de ácido y gas, más o menos rápidamente, en un periodo de
48 horas y con una temperatura de incubación comprendida entre 30-37ºC.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados. Del grupo
coliforme forman parte varios géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se
encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: agua,
suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe a
un fallo en el tratamiento en la planta, sino a un recrecimiento de las bacterias en las
conducciones. Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones,
mientras no se demuestre lo contrario.
Dentro del grupo de los coliformes totales existe un subgrupo que es el de los Coliformes fecales.
Los coliformes fecales son coliformes totales que además fermentan la lactosa con producción de
ácido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y 45ºC en presencia de sales
biliares. Los coliformes fecales comprenden principalmente Escherichia coli y algunas cepas de
Enterobacter y Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran índices de contaminación fecal. Pero el
verdadero índice de contaminación fecal es Escherichia coli tipo I ya que su origen fecal es seguro.
2. OBJETIVOS
Conocer y aplicar la técnica de filtración de membrana para la identificación de
microorganismos asociados a procesos de contaminación.
3. CONSULTAS PRELIMINARES
Consulte sobre el método denominada NMP (Numero más probable y haga una protocolo
para levar a cabo este procedimiento.
¿Esta técnica se puede usar en alimentos?
4. MATERIALES Y REACTIVOS
4.1 Material que debe llevar cada estudiante
Muestra de agua de acuerdo a la guía anterior
4.2 Material suministrado por el laboratorio
Membranas filtrantes de 0,45 µm de
tamaño de poro
Pipetas estériles de 10 y 1 mL.
Estufa de cultivo

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Soporte del filtro con embudo
Sistema de vacio
Asa de siembra
Pinzas estériles
4.3 Reactivos
Agar Endo
5. PROCEDIMIENTO
El volumen de muestra a filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en las
que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en aguas superficiales y en general
en aguas naturales sin tratar, el número de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas
hasta cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que pueden servir de
orientación:
Tipos de agua Coliformes totales
Potable de consumo público 100 ml
Envasadas 250 ml
Manantiales 15; 60; 100 ml
Lagos, depósitos 4; 15; 60; 100 ml
Acometidas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas 0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ríos 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas 0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar 0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml
Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran directamente añadiéndolas al embudo
de filtración.
Para muestras entre 1 y 30 ml, se añaden primero al embudo 20-30 ml de solución tamponada
estéril y, encima de ella, se vierte la muestra a filtrar.
Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso realizar previamente diluciones con solución
tamponada estéril.
Preparación de diluciones
Para realizar una dilución 1/10 (10
-1
), se pipetea
asépticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9
ml de solución tamponada estéril y se agita.
Muestra
1 ml
+
Diluyente
9 ml
=
Dilución
1/10 (10
-1
)
Para realizar una dilución 1/100 (10
-2
), se pipetea
1 ml de la dilución 1/10 en otro tubo con 9 ml de
solución tamponada estéril y se agita.
Dilución
1/10 (10
-1
)
+
Diluyente
9 ml
=
Dilución
1/100 (10
-2
)
Así sucesivamente se van haciendo las diluciones que se necesiten, dependiendo del grado de
contaminación esperado de la muestra.
5.1 Medio de cultivo selectivo para Coliformes Totales: Caldo Endo, MF
Se utiliza el Caldo Endo para el recuento de coliformes totales. Este es un medio para el
aislamiento selectivo de los coliformes totales pues lleva inhibidores para el resto de

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microorganismos. El lauril sulfato y desoxicolato que forman parte de la fórmula del medio permite
crecer a los coliformes lactosa positivo pero inhibe el crecimiento del resto de bacterias
acompañantes. Las colonias lactosa positiva se colorean de rojo por la liberación de fucsina del
sulfato de fucsina. Las colonias de E. coli y de los coliformes muestran generalmente un brillo
metálico.
Se utiliza este medio para la identificación y recuento de coliformes en agua, leche y otros líquidos
mediante filtración sobre membrana y está incluido en las recomendaciones de la APHA
"American Water Works Association and Water Pollution Control Federation: Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 2004 ".
5.2 Técnica de filtración sobre membrana
Desenvolver el filtro de la envoltura con la que se ha esterilizado.
Separar el embudo de la base del filtro.
Colocar la membrana filtrante de 0,45 µm de tamaño de poro sobre el portafiltros de las
base del mismo.
El manejo de las membranas se debe realizar con pinzas de punta plana o guantes de
goma para no lesionarlas.
Colocar el embudo sobre la base, teniendo cuidado de no lesionar la membrana y que esta
quede bien centrada. La membrana filtrante queda ahora situado entre el embudo y la
base-soporte del filtro.
Filtrar 100 mL de la muestra de agua a través del filtro. Poner en marcha el sistema de
vacio.
Una vez filtrada toda la muestra, parar el sistema de vacio y separar el embudo de la base
del filtro.
Retirar con pinzas estériles o flameadas la membrana filtrante.
Colocar la membrana sobre la placa con la almohadilla absorbente y el caldo Endo, de
forma progresiva para evitar que queden burbujas entre la membrana y el medio y que
quede asegurado el contacto entre la membrana y el medio.
Colocar la tapa de la placa de Petri, invertir la placa e incubar en estufa a 37ºC durante 24
horas
En este medio todos los coliformes crecen formando colonias de color rojo oscuro con el
característico brillo metálico de Escherichia coli de color verde-azulado aunque en los
géneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter no es tan intenso como en Escherichia y
puede pasar desapercibido.
Los resultados se expresan en UFC/100 mL.
6. RESULTADOS
Cuando se obtienen recuentos de más de 200 colonias sobre una misma membrana pueden dar
resultados erróneos debido a la superpoblación, ya que lo que aparece como una colonia puede
ser originado por varias bacterias bajo condiciones de hacinamiento. En estos casos debemos
volver a muestrear el agua y analizar muestras más diluidas.
Por otra parte, un número de colonias inferior a 10 ó 20 por membrana es poco fiable como base
para establecer cuantitativamente la concentración bacteriana de la muestra. Por ejemplo, la
obtención de 2 colonias a partir del análisis de 1 ml de un agua, no nos permite afirmar que esa
agua contenía 200 colonias en 100 ml. En estos casos conviene repetir el análisis filtrando un
volumen de muestra mayor.

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Cuando el recuento de colonias está entre 20-200, los resultados se expresan:
Si hemos analizado una muestra sin diluir: Recuento de colonias = UFC / volumen de muestra
filtrada.
Si hemos analizado una muestra diluida: Recuento de colonias x Factor de dilución = UFC/
volumen de muestra filtrada.
No olvide concluir y analizar los resultados.
7. BIBLIOGRAFIA
Standar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 18th ed.
Pagina web
http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/toma_muestra/toma_muestras.html#1
Revisada el 2 de noviembre de 2012.
Adaptado por: Revisado por:
Adriana Marcela Peña Quina
Bióloga – Docente programa de Ecología
Arnol Arias
Biólogo – Coordinador de laboratorio