Este documento describe la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectar autoanticuerpos. La IFI utiliza sueros de pacientes y diferentes sustratos como células HEp-2 y tejidos de riñón de rata. El procedimiento incluye incubar las muestras en las placas, lavar, agregar conjugado marcado con FITC, e interpretar los patrones de fluorescencia bajo microscopio. El documento también cubre los controles, materiales, y la interpretación de los resultados como negativos o positivos con diferentes patrones como

1. Informe de Técnica de
Inmunofluorecencia
Inirecta (IFI)
por
Miguel Angel Figueroa Núñez
Inmunología Clínica
TM. Marcelo Ramirez Sandoval

2. TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
2
¿QUÉ ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA?
¿PRINCIPIO DE LA TECNICA?
SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA
OBJETIVOS
2
2
3
3
MATERIALES Y METODOS
4
MATERIALES UTILIZADOS
METODO OCUPADO
DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO
PROCEDIMIENTOS
CONTROL DE CALIDAD
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
RESUMEN DE LA TECNICA
4
4
4
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6
7
7
INTERPRETACIÓN
8
RESULTADOS OBTENIDOS
LECTURA DE LOS RESULTADOS
VALORES DE REFERENCIA
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
SIGNIFICADOS CLÍNICOS
DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN
BIBLIOGRAFÍA
1
8
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13
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14
15
16

3. INTRODUCCION
¿QUE ES LA INMUNOFLU ORECENCIA INDIRECTA?
La inmunofluorecencia indirecta es un examen que se realiza a travez de la capacidad de
poder ver por medio de un microscopio UV la estimulación de un anticuerpo marcado con
un fluorocromo.
Se realiza mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta, que es la técnica de
elección para el screening de detección de estos autoanticuerpos debido a su alta
sensibilidad cuando el resultado es positivo con un título alto (1/160). Sin embargo presenta
una baja especificidad, por lo cual, su resultado siempre debe ser interpretado dentro del
contexto clínico del paciente. Ante un resultado positivo, y dependiendo del patrón
obtenido, generalmente es necesario continuar los estudios serológicos en busca de los
antígenos específicos asociados, para lo cual se utilizan inmunoensayos de mayor
especificidad, como el ELISA.
PRINCIPIO DE LA TECN ICA
Para la detección de AAN se emplea la técnica de inmunofluorescencia indirecta IFI,
utilizando como sustrato laminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human
Epithelioma type - 2,) esta línea celular deriva de carcinoma laríngeo humano), utilizando
como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina G humana) conjugado con
fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al observarse bajo
luz ultravioleta de alta energía (495 nm). Beck observo en 1961, que los sueros positivos
muestran patrones muy diferentes de fluorescencia nuclear, los que se describen como
Homogéneo, Periférico, Nucleolar, Moteado y centrómero. Actualmente ha cobrado gran
importancia la incorporación en los informes de la presencia de patrón citoplasmático
cuando éste es observado, debido a la gran ayuda en el diagnóstico, cuando se trata de
anticuerpos anti-mitocondrias o anticuerpos anti-músculo liso. Otro punto importante es la
información de patrones mixtos
2

4. SU UTILIDAD EN LA IN MUNOLOGÍA CLÍNICA
La detección de autoanticuerpos en
autoinmunes como:







el diagnóstico de diferentes enfermedades
Lupus Eritematoso Sistémico.
Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo.
Síndrome de Sjogren.
Esclerosis Sistemática Progresiva.
Síndrome de CREST.
Cirrosis Biliar Primaria.
Artritis Reumatoide
OBJETIVOS
1.
2.
3
Detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra:
a. Antígenos tisulares, como anticuerpos antinucleares (ANA),
antimitocondriales (AMA), antimúsculo liso (ASMA), anti-DNA,
antiendomisio (AAE) y anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos
(ANCA) mediante el método de inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Identificar los diferentes patrones y sustratos utilizados.

5. MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES UTILIZADO S
INSUMOS













PBS (Solución Buffer Fosfato) preparado 4 Placas Anticuerpos antinucleares.
Conjugado anti-inmunoglobulina G humana Universal (FITC) 5.0 ml. Inc.
Medio de montaje
Kit de detección Anticuerpos Antinucleares.
Micropipeta de 100 ul, 200ul, 1000ul
Puntas para Micropipetas (amarillas 200 ul. Azules 1000 ul.)
Tubos de Khan 75x13 mm
Cámara Húmeda de Incubación
Papel Filtro
Porta objetos 26x76 mm
Cubre objetos 24x50 mm
Cronómetro
Guantes
EQUIPOS


Microscopio para inmunofluorescencia
Vortex
DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO
Para la detección de autoanticuerpos presentes en muestras de sueros, se emplea la técnica
de inmunofluorescencia indirecta IFI, utilizando como sustrato:





Para ANA, láminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human
Epithelioma type-2, derivado de carcinoma laríngeo humano).
Para ANCA, láminas de células polimorfos nucleares.
Para ASMA corte de tejido de hígado de rata.
Para AMA corte de tejido de riñón de rata.
Para Antiendomisio corte de tejido de esófago de mono.
Se agrega sobre estos sustratos el suero del paciente en estudio a una determinada dilución
dependiendo del autoanticuerpo específico que se busca. La unión antígeno-anticuerpo se
evidencia utilizando como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina humana)
conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al
4

6. observarse bajo luz ultravioleta de alta energía (495 nm) en un microscopio de
fluorescencia con luz incidente.
PROCEDIMIENTO
1
2
3
4
Retirar del refrigerador el número de placas o pocillos de células HEp-2 y el
Conjugado anti-inmunoglobulina G Humana Universal FITC. Dejar que todos
los reactivos se estabilicen a la temperatura ambiente por 20 minutos.
Preparar solución PBS pH 7.2
Dejar que las muestras se descongelen a temperatura ambiente por 20 minutos.
Diluir las muestras de suero con PBS según la siguiente tabla con PBS, mezclar.
Examen
AAN
ADNA
ASMA
AMA
ANCA
EMA
Sustrato
HEp-2
C.luciliae
Riñón/Estom.
Riñón/Estom.
P.M.N.
Esof./mono
Conjugado
AntiIGG h.
Immco 2100
Immco 2100
Immco 2100
Bindig Site
Mico 2113
AntiIGG h.
AntiIGG .h.
AntiIGG h.
AntiIGG h.
AntiGAMh
Dilución
1/40
1/10
1/20
1/20
1/20
1/2.5
Vol.Mx ul.
25
25
25
25
25
100
Vol.PBS ul
1000
250
500
500
500
150
5
6
7
8
9
10
11
12
5
Preparar cámara húmeda, se debe mojar el papel filtro que está en ella con PBS
y eliminar el excedente
Extraer el número de placas según el examen a realizar y colocarlas en la cámara
húmeda.
Enumerar las placas
Utilizar en los 2 primeros pocillos de las placas, control positivo, negativo cada
vez que se realice la técnica
Colocar 30 ul de Control negativo en el primer pocillo, 30 ul de control positivo
en el segundo pocillo.
Colocar 30 ul de las muestras diluidas en los siguientes pocillos dependiendo del
número de muestras a analizar, verificar que los pocillos queden completamente
cubiertos
Tapar la cámara húmeda con las placas en su interior. Incube por 30 minutos a
temperatura ambiente. No mover la cámara.
Hacer un esquema de las placas en el cuaderno de registros de IFI dibujando
exactamente el número de placas ocupadas y poniendo en cada cuadro que
representa un pocillo en número de la muestra procesada.

7. 13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Lavar las placas durante 10 minutos en la misma cámara húmeda de incubación,
agregando PBS hasta cubrirlas.
Eliminar el PBS y lavar nuevamente por 10 minutos.
Eliminar nuevamente el PBS y secar las placas con papel absorbente evitando que
los pocillos entren en contacto con éste
Colocar las placas en la cámara húmeda y agregar 30 ul. de conjugado
correspondiente según el sustrato utilizado a cada pocillo.
Tapar la cámara húmeda e incubar 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad
Lavar nuevamente 2 veces por 10 minutos con PBS en oscuridad.
Secar las placas con papel absorbente y agregar medio de montaje a cada pocillo
de la placa.
Leer con microscopio de fluorescencia en habitación oscura.
Determinar el patrón de fluorescencia nuclear y registrar las lecturas de exámenes
en registro de IFI.
Si la muestra es positiva en la dilución de detección, determinar el valor realizando
diluciones múltiplo de 2 Ej. 1/80(Que no se tomara en cuenta en esta ocasión)1/160, hasta 1/640, si él título de la muestra en estudio es mayor informar titular
hasta punto final.
CONTROL DE CALIDAD
Como anteriormente hemos realizado los controles de calidad se deben colocar a principio
de los pocillos de reacción siendo primero en control negativo y segundo el control
positivo.
El Control Positivo debe proporcionar el marcaje específico descrito en el apartado
anterior.
El Control Negativo no debe proporcionar marcaje específico alguno.
Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de
Calidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no
cumplan con las tolerancias aceptables.
También es importante considerar estos puntos:
•
•
•
6
Capacidad para revelar la presencia de anticuerpos.
Ser metódico en el uso de los materiales para esta técnica y así
observar una buena corrida electroforética.
Seguir las instrucciones de la técnica.

8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Informar Resultado (negativo ó positivo), patrón nuclear y título obtenido.
RESUMEN DE LA TECNICA
Después de colocar las muestras en cada placa seguir el siguiente esquema.
INCUBAR 30 MINUTOS A 20 -25 °C
LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25
AGREGAR CONJUGADO E INCUBAR 30 MIN.A 20-25 °C EN OSCURIDAD
LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25
AGREGAR MEDIO DE MONTAJE Y LEER EN MICROSCOPIO DE IFI
INFORMAR PATRON Y TITULO OBSERVADO
7

9. INTERPRETACIÓN
RESULTADOS OBTENIDOS
Los dos primeros 2 pocillos son los controles positivo y negativo respectivamente, mientras
el control positivo presento un marcaje especifico, el control negativo mostro un marcaje
inespecífico, suave y homogéneo.
Luego en el pocillo 1 se coloca el control de patrón homogéneo (H), este se puede observar
en la imagen 2 que se muestra como ejemplo a continuación.
IMAGEN 2
8

10. A continuación en el pocillo 2 se coloca el control Moteado (M) se presentan en la imagen
3 que proponemos como ejemplo de enseguida.
IMAGEN 3
Después en el pocillo 3 se coloca el control Nuclear (N) que se expone en la Imagen 4 que
sigue a continuación.
IMAGEN 4
Y por último en el pocillo numero 4 colocamos el control del patrón centromérico (C) que
está en la presente imagen 5.
IMAGEN 5
9

11. Luego después de los controles pasamos las muestras las cuales dan negativas hasta el
suero 42 el cual resulta positivo y se realizan 3 diluciones, de las cuales solo usaremos
1/160 y 1/320. Las imágenes obtenidas se muestran a continuación.
SUERO 12, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 6)
SUERO 22, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 7)
10

12. SUERO 32, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 8)
SUERO 42, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 9)
11

13. SUERO 42, DILUCIÓN 1/160, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 10)
SUERO 42, DILUCIÓN 1/320, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 11)
12

14. LECTURA DE LOS RESULTADOS
Imagen 12.
La observación de marcaje fluorescente específico descrito a continuación indica un
resultado positivo a la dilución recomendada.
ANA: Existen diferentes patrones de fluorescencia nuclear que pueden coexistir en un
mismo suero e incluso modificarse con la dilución del mismo. Los principales patrones
anti-nucleares son:





Homogéneo: Fluorescencia uniforme y homogénea en todo el interior del
núcleo de la célula en interfase. Fluorescencia intensa en las células en
mitosis.
Periférico: Marcaje en la periferia del núcleo, de mayor intensidad en el
perímetro interior, y marcaje homogéneo en el resto del núcleo.
Moteado: Marcaje fluorescente en forma de granulado grueso. Los nucléolos
no están marcados. Los gránulos pueden tener tamaños y formas diversas
dependiendo del antígeno que reacciona.
Nucleolar: Existen dos patrones nucleolares:
o Marcaje nucleolar de patrón homogéneo. A menudo acompañado de
un débil marcaje homogéneo en el resto del núcleo.
o Marcaje moteado de los nucléolos en células en interfase. Marcaje
puntual de las regiones organizadoras de los cromosomas mitóticos.
Centromérico: Punteado discreto en las células en interfase (46 puntos o
múltiples). Los puntos se alinean con los cromosomas en las células en
metafase.
Las muestras positivas pueden titularse. Se define el título como la dilución mayor que da
resultado positivo.
Cuando no se observa ninguno de los marcajes específicos descritos, el resultado es
negativo para los autoanticuerpos indicados.
VALORES DE REFERENCIA
Los valores de referencia indican negatividad he inespecificidad del marcaje de la de las
células HEp-2 en los pocillos.
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15. INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS
Como se describe anteriormente, los sueros, 12, 22, 32 resultaron ser negativas, las cuales
presentaron un patrón homogéneo e inespecífico en todas las células.
Sin embargo en el suero 42 se observa positividad así como en sus posteriores diluciones,
delas cuales podemos decir que tienen un patrón moteado.
SIGNIFICADOS CLÍNICOS
ANA: La determinación de anticuerpos anti-nucleares tiene una sensibilidad superior al
95% para el lupus eritematoso sistémico, y una baja especificidad2.
Homogéneo: Indicativo de lupus eritematoso sistémico.
Periférico: En pacientes con enfermedades del tejido conectivo.
Moteado: Asociado al lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo,
síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma.
Nucleolar: En aproximadamente un 50-70% de pacientes con solapamiento de
escleroderma y polimiositis/dermatomiositis. Se presenta en hasta un 33% de pacientes con
escleroderma sistémica, especialmente con complicaciones renales2.
Centromérico: En pacientes con esclerosis sistémica, especialmente en la forma de la
enfermedad con implicación cutánea (80%). Ocasionalmente, en otras enfermedades
conectivas3.
El diagnóstico clínico no debe basarse exclusivamente en el resultado de este ensayo, sino
que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Como se menciona anteriormente, el suero 42 es el único que presenta positividad nuclear,
con un patrón moteado. Este patrón esta asociado al lupus eritematoso sistémico,
enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma.
El experimento se realizó con normalidad y no presento mayores dificultades, sin embargo
solo fue posible fotografiar las muestras debido al tiempo que llevaba ver y analizar cada
uno de los sueros, para ver su patrón he indicar el resultado.
Debido a los antecedentes podemos decir que la se describieron anteriormente, puedo decir
que el suero 42 es positivo, con una concentración de anticuerpos mayor a 1/320,
probablemente con Lupus Eritematoso Sistémico, pero debe ser confirmado con otros
análisis y con la clínica del paciente.
Esto también es un antecedente de cómo podemos utilizar la capacidad de fijación de las
células a un portaobjetos (HEp-2) y ver como se unen los anticuerpos presentes en los
14

16. sueros problemas, los cuales se conjugan con Anticuerpos marcados con FITC, lo que dará
como resultado un color verde como respuesta a la estimulación con luz ultravioleta.
Esta tecnología resulta de vital importancia y hoy está en gran parte de los laboratorios y
campos clínicos de Chile, pero es un análisis caro y requiere de entrenamiento por parte de
los que lo manipulan y observan. Por lo que se convierte en una herramienta de gran ayuda
aprenderla, reconocerla y ponerla en práctica para salir altamente preparados para enfrentar
la labor clínica.
REFERENCIAS
1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología
Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6.
2) Figueroa, Miguel. Fotografías prueba Inmunofluorecencia
Indirecta. 2013. 6-11. Universidad Iberoamericana de Ciencias y
Tecnología, Ramo Inmunología Clínica.
3) Imágenes obtenidas en google (obtenidas bajo es buscador de
imágenes (1-5). 2013.
https://www.google.cl/search?q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+he
p-2&espv=210&es_sm=93&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=ebGUq2AGdWq4APOv4HoDQ&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1137&bih=595&d
pr=0.9#es_sm=93&espv=210&q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+h
ep-2+patron+centromerico&tbm=isch&imgdii=_
4) Imagen 12 obtenida del inserto: ” ANTI-NUCLEAR ANTIBODIES
hep-2 (ANA-hep-2)”. BioSystem. 2006.
5) Robles Marhuenda, A. Ramos-Casals, M. “Significado clínico de
los anticuerpos antinucleares”. 2005. Doyma.es.
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