Este reporte describe un experimento de tinción de Gram realizado por tres estudiantes para identificar microorganismos aislados de diferentes muestras. El experimento involucró la tinción de colonias cultivadas en placas de agar utilizando cristal violeta, lugol y safranina para diferenciar entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas bajo un microscopio óptico. Los estudiantes tuvieron dificultades aislando correctamente los microorganismos y siguiendo precisamente los pasos de la tinción, pero lograron identificar diferentes mor

1. Universidad Autónóma de Queretaró
Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #3:
Tinción de microorganismos
Laboratorio de Biodiversidad de los
Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz
Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
1 de octubre del 2013

2. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos, son seres vivos muy pequeños que solo pueden verse a
través de un microscopio, por lo que antes de su invención nadie tenía conocimiento
de la existencia de microorganismos, dicho esto, la microbiología nació con el primer
microscopio, el cual fue inventado por Antoni van Leeuwenhoek y es el instrumento
microbiológico de mayor importancia.
En la actualidad tenemos diferentes tipos de microscopios que van desde los
más básicos hasta los más novedosos y avanzados, éstos nos permiten observar
cosas tan pequeñas como estructuras internas celulares, microorganismos en
tercera dimensión, así como su morfología; todos los microscopios utilizan lentes
para aumentar el tamaño de los microorganismos o células y así hacerlas visibles al
ojo humano.
Para poder observar dichos microorganismos existen varios métodos los cuales
dependen del tipo de microscopio que se va a utilizar así como del objetivo de la
observación.
En este caso específico, nosotros utilizamos un microscopio óptico de campo
claro el cual se utiliza para observar células a bajos aumentos. El microscopio óptico
usa la luz para iluminar las estructuras celulares; las propiedades físicas de dicha luz
determinan la resolución del microscopio, por lo tanto nuestra resolución está
limitada. Los límites en la resolución de un microscopio óptico están en
aproximadamente 0,2 µm.
En el microscopio de campo claro las muestras se visualizan gracias a los
contrastes diferentes entre las células y el campo que las rodea (la luz); estas
diferencias se dan por que las células absorben o dispersan la luz en diferentes
grados.
En nuestra práctica usamos el método de tinción de gram para poder visualizar
nuestras células. La tinción de gram es un método de contraste en tinte de tipo
diferencial, esto quiere decir que requiere de más de un tipo de colorante y se utiliza
para distinguir entre varios tipos de células bacterianas, una tinción diferencial por lo
general consiste en 3 pasos: primero se pone un colorante primario el cual tiñe a
todas las células de nuestra muestra, después sigue una decoloración que removerá
el colorante solo de ciertos tipos de células, y finalmente se utiliza un colorante de
contraste, el cual tiñe las células que se decoloraron pero no tiene efecto sobre las
que aún tienen el color primario. La tinción de gram es una de las tinciones más
utilizadas en microbiología, esta tinción se basa en la cantidad de peptidoglicano que
se encuentra en las paredes celulares bacterianas.
El fundamento detrás de esta tinción radica en que las bacterias G+ poseen una
capa de peptidoglicano y dos clases de ácidos teicoicos (polímeros de glicerol o
ribitol unidos mediante enlaces fosfodiéster), uno se encuentra en la parte interna de
la pared celular unido a la membrana citoplasmática y se llama ácido lipoteicoico; y
el otro se encuentra anclado solamente en el peptidoglicano (mureína). En las
bacterias G– la capa de peptidoglicano es delgada y se encuentra unida a una
segunda membrana citoplasmática exterior, por medio de lipoproteínas, la

3. membrana externa de las G– es soluble en solventes orgánicos como el alcohol o la
acetona y su capa de peptidoglicano es demasiado delgada para poder retener el
tinte de cristal violeta/yodo.
OBJETIVO
Aprender a activar y aislar cultivos así como a ejecutar correctamente la técnica
de tinción de gram para la observación de la morfología bacteriana y la
diferenciación primaria de microorganismos.
Familiarizarse con el uso del microscopio óptico de campo claro.
MATERIALES
Cepas activadas Alcohol – acetona Recipiente de
plástico rectangular
Porta objetos Safranina Guantes de nitrilo
Solución salina Pinzas metálicas Microscopio óptico
Cristal violeta Asas calibradas Mechero bunsen
Lugol Varillas de vidrio y manguera
de látex
METODOLOGÍA
Pasos para realizar la tinción de gram:
1. Realizar frotis
2. Fijar
3. Agregar Cristal Violeta y dejar por 1 minuto
4. Enjuagar
5. Agregar Lugol y dejar por 1 minuto
6. Enjuagar
7. Decolorar con alcohol – acetona
8. Enjuagar
9. Agregar Safranina y dejar por 1 minuto
10. Enjuagar
11. Observar en el microscopio

4. Diagrama de flujo para realizar la tinción de gram.
Inicio
Esterilizar el asa con calor
Limpiar el portaobjetos con
alcohol o esterilizar con calor.
Prender el mechero
Enjuagar
Dejar secar
Poner la muestra en la gota de
solución salina y realizar frotis
Tomar muestra de la
cepa activa
Observar al
microscopio
Agregar safranina y esperar
1 min. Enjuagar. Dejar secar
Agregar cristal violeta
y esperar 1 min
Fin
Tomar una gota de solución salina
y ponerla en el portaobjetos
Agregar lugol y
esperar 1 min
Agregar alcohol – cetona y
enjuagar inmediatamente

5. RESULTADOS
Rebeca
# DE
COLONIA
ORIGEN DE LA
MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO
PROVENIENTE
MORFOLOGÍA
MICROSCÓPICA
GRAM
IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1 Nariz AS – Agar sangre Cocos G +
2 Nariz AS – Agar sangre Cocos G +
3 Tierra AP – Agar pseudomonas Bacilos G –

6. 4 Tierra AP – Agar pseudomonas Cocos G +
5
Heces fecales
de animal
EMB – Agar eosina azul de
metileno
Bacilos G –
6 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Cocos G +
7 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa Bacilos G +

7. 8 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa Bacilos G +
9 Nariz ABP – Agar Baird Parker Cocos G +
Marina
# DE
COLONIA
ORIGEN DE LA
MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO
PROVENIENTE
MORFOLOGÍA
MICROSCÓPICA
GRAM
IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1 Garganta ABP – Agar Baird Parker Cocos G +

8. 2 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos G +
3 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos G –
4 Garganta AS – Agar sangre Cocos G +
5 Tierra AP – Agar pseudomonas Bacilos G –

9. 6 Tierra AP – Agar pseudomonas Bacilos G +
7 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa Bacilos G +
8 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa Bacilos G +
9 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa Bacilos G +

10. Juana
# DE
COLONIA
ORIGEN DE LA
MUESTRA
MEDIO DE CULTIVO
PROVENIENTE
MORFOLOGÍA
MICROSCÓPICA
GRAM
IMAGEN DE OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO
1
Heces fecales
de animal
EMB – Agar eosina azul de
metileno
Bacilos -
2 Agua de tortuga VB – Agar verde brillante Bacilos -
3 Agua de tortuga VB-Agar verde brillante Bacilos -

11. 4 Garganta AS – Agar sangre cocos +
5 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa bacilos +
6 Agua de tortuga AST – Agar soya tripticasa bacilos -
7 Garganta ABP – Agar Baird Parker cocos -

12. 1. Realizar frotis 2. Fijar 3. Agregar el cristal violeta y
dejar durante 1 min
8 Tierra AP – Agar pseudomonas bacilos -
9 Tierra AP-Agar pseudomonas cocos +

13. 4. Enjuagar 5. Agregar Lugol y dejar
durante 1 minuto. Enjuagar
6. Decolorar con alcohol –
acetona. Enjuagar
inmediatamente
7. Agregar safranina y dejar
durante 1 minuto. Enjuagar
8. Dejar secar y observar al
microscopio(10x)
9. Observar en el microscopio a
(40x)

14. 10.Observar en el microscopio
(100x)
DISCUSION DE RESULTADOS
En ésta práctica nuestro mayor problema fue el no poder aislar los microorganismos
correctamente, por esta razón tuvimos que repetir el aislamiento para así poder tomar una muestra
de nuestras colonias ya aisladas y por ende obtener un buen frotis. Otro aspecto importante es
esterilizar nuestro porta-objetos antes de utilizarlo, así como utilizar el asa correctamente a la hora
de hacer el frotis ya que de no hacerlo así, podríamos tener nuestras bacterias muy juntas y esto nos
imposibilitaría el poder identificarlas. Con respecto a la tinción, es muy importante seguir las
indicaciones al pie de la letra, ya que de no hacerlo así podríamos tener un resultado alterado, por
decir algo, podríamos dejar el alcohol – acetona un poco más de tiempo y esto haría que nuestra
tinción se vuelva más rosada que morada, afectando nuestro criterio.
CONCLUSIÓN
La activación de colonias en agar soya tripticasa ayudo a la rápida proliferación de colonias,
gracias a esto, pudimos realizar la tinción de Gram satisfactoriamente aunque cabe mencionar que
aún nos falta mucha práctica para obtener una tinción más limpia. Se aprendió a realizar la tinción de
Gram en bacterias así como a observar e identificar su morfología, cabe mencionar que gracias a la
tinción de gram, podemos inferir el tipo de pared celular que tienen nuestras colonias dependiendo
de la tinción que hayan agarrado ya sea la del azul violeta o la de safranina. Por ultimo aunque
igualmente importante, aprendimos a utilizar correctamente un microscopio y observamos nuestras
bacterias.
BIBLIOGRAFÍA
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial
Pearson
Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana