Medios de cultivo diferenciales

Medios diferenciales
Son empleados para detectar reacciones
bioquímicas, con carácter diferencial de grupos, géneros
o especies microbianas, mediante el viraje de color del
indicador presente en el medio, demostrando algunas de
sus características.
Estos medios son el TSI, LIA, Citrato de Simmons,
SIM, Caldo úrea.

Medios diferenciales
LIA

UREA

TSI (Triple Sugar Iron)
• Color: rojo ladrillo
• Inhibidores: no tiene
• Indicador: rojo de fenol
• Sustratos principales: lactosa, sacarosa y
glucosa (la proporción en el medio de lactosa y
sacarosa es de 10: 1 con la glucosa)
• Sustratos secundarios: tiosulfato sódico,
peptona, citrato férrico amoniacal y extractos.
• Se siembra por picadura profunda con aguja y
luego se siembra por estrías en el pico

En este medio se busca determinar la capacidad de la
bacteria para degradar los azúcares y la formación de gas y de
H2S.La fermentación aeróbica se produce en el pico de tubo y la
anaeróbica en el fondo del tubo.
La degradación de la lactosa ocurre en la parte superior,
la de la sacarosa en la parte intermedia y la de la glucosa en la
parte profunda, produciéndose un viraje del rojo al amarillo.
El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el
citrato férrico amoniacal para dar formación al sulfuro de fierro
que es de color negro.
La presencia de gas se debe al CO2 producto de la
fermentación.

1.- Rx en bacterias glucosa, lactosa y sacarosa +

A/A +;Ej.:
Escherichia
coli

A/A -;Ej.:

Vibrio
cholerae


A/A ++, ++
Ej.: Citrobacter freundii

2.- Rx en bacterias solo fermentadoras de glucosa (glucosa +;
lactosa y sacarosa -)

K/A -, ++++

K/A -;-

Ej.: Proteus
mirabilis

Ej.: Shigella
flexneri

3.- Bacilos no fermentadores

N/N -;Pseudomonas
* Este resultado no es de una
enterobacteria

LIA (Lysine Iron Agar)
• Color: lila
• Indicador: púrpura de bromocresol
• Sustratos principales: lisina y glucosa
• Sustratos secundarios: peptona, tiosulfato de
sodio, extracto de levaduras.
• Se siembra por picadura profunda con aguja y
luego por estrías en el pico

En este medio se permite evidenciar la descarboxilación
del aminoácido lisina en la diamina cadaverina, como también la
desaminación de la lisina en un alfa cetoácido. Esta 2 reacciones
se ponen de manifiesto por el viraje del indicador púrpura de
bromocresol.
La formación de H2S se pone de manifiesto por la
presencia del tiosulfato sódico, que dará formación al sulfato
férrico.
También puede verificarse la formación de gas a partir de
la degradación de la glucosa.

1.- Lisina descarboxilasa +

Lisina

lisina
descarboxilasa

Ej.: Escherichia coli

cadaverina (alcaliniza el
medio)

2.- Lisina descarboxilasa +, H2S +

Ej.: Salmonella

3.- Lisina descarboxilasa -

Ej.: Shigella

4.- Lisina deaminasa +

Lisina

Lisina deaminasa

Ej.: Proteus mirabilis

alfa cetácido


N/N -;Pseudomonas
* Este resultado no es de una
enterobacteria

Citrato de Simmons
• Color: verde
• Inhibidor: no tiene
• Indicador: azul de bromotimol
• Sustrato principal: citrato de sodio
• Sustratos secundarios: fosfato
dipotásico, cloruro de sodio, sulfato de
magnesio y fosfato monoamónico.
• Se siembra por picadura profunda con
aguja y luego por estrías en el pico.

Citrato de Simmons
Este medio nos permite comprobar la capacidad de la
bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de
carbono.
La degradación del citrato conlleva a la alcalinización del
medio y el viraje del indicador azul de bromotimol de verde a
azul prusia.
Con este medio podemos diferenciar entre las coliformes
fecales y bacterias de los grupos Enterobacter y Citrobacter
así como algunas especies del grupo Salmonella.

Citrato de Simmons
1.- Citrato positivo:
La bacteria consume el citrato
como fuente exclusiva de carbono
Cit- Na+

citritasa

Cit+ Na+ OH

–

alcaliniza el
medio
Ej.: Klebsiella pneumoniae

Citrato de Simmons
2.- Citrato negativo
La bacteria no consume el
citrato como fuente de carbono.

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
• Color: crema
• Indicador: no tiene
• Sustrato principal: peptona
• Sustrato secundario: tiosulfato sódico, hierro y
amonio
• Este medio se utiliza para comprobar la motilidad,
la formación de H2S y la producción de indol por
parte de la bacteria.
• Se siembra por picadura

La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa
del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no
motilidad se caracteriza por el crecimiento producido
exclusivamente a lo largo de la línea de inoculación.
La producción de H2S se reconoce por el ennegrecimiento
de la zona de crecimiento o del medio debido a la presencia del
tiosulfato sódico.
Para la demostración del indol se usa el rvo de Kovacs, que
manifiesta la degradación del triptófano por la enzima
triptofanasa en indol, que se combina con el aldehído presente en
el rvo de Kovacs, para producir un color rojo.

1.- Motilidad positiva

2.- Motilidad negativa

Presencia de
turbidez difusa en
el medio.

Presencia de
crecimiento solo en
el sitio de punción

Ej.: Escherichia
coli

Ej.: Klebsiella
oxytoca

1.- H2S positivo

Ej.: Proteus vulgaris

2.- H2S negativo


1.- Indol positivo


2.- Indol negativo

Ej.: Salmonella sp.

Caldo Úrea
• Color: rosado
• Sustrato principal: úrea
• Sustrato secundario: extracto de levaduras,
fosfato monopotásico y fosfato disódico.
• Este medio no se autoclava

Caldo Úrea
En este medio se observa la capacidad de la bacteria de
degradar la úrea por medio de la enzima ureasa formando
amoniaco y carbonato de amonio, que alcalinizan el medio por lo
cual el rojo de fenol vira a un rojo cereza.
• Bacterias úrea + rápida: Proteus y Providencia
• Bacterias úrea + retardada: Klebsiella, Citrobacter y
Enterobacter.
• Bacterias úrea negativa: Escherichia coli, Salmonella, Shigella

Caldo Úrea
1.- Úrea positiva
•Rápida

• Retardada

Ejm.: Proteus
mirabilis

Ejm.: Klebsiella
pneumoniae

Caldo Úrea
2.- Úrea negativa


Otros medios diferenciales
y pruebas bioquímicas

KIA (Kligler Iron Agar)
• Color: rojo
• Sustratos principales: lactosa y
glucosa
• Sustratos secundarios: peptona,
extractos y tiosulfato sódico.
• Se siembra por picadura profunda con
aguja y luego se siembra por estrías en
el pico

Este medio se emplea para la identificación de bacilos
gram – basada en la fermentación de la lactosa y la glucosa y
en la producción de H2S.
Los organismos que fermentan glucosa pero no lactosa
mostrarán un crecimiento K/A, mientras que los que si
fermentan lactosa mostrarán un resultado A/A, con o sin
formación de gas .
La formación de H2S se demostrará por el
ennegrecimiento del medio.
Si el tubo no muestra ningún cambio es porque la
bacteria no consume ni lactosa ni glucosa.


A/A +;-

K/A -;-

Ejm: Escherichia
coli

K/A -;++++

Ejm:Shigella

Ejm: Proteus

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
• Color: lila
• Indicador: púrpura de bromocresol
• Sustratos principales: ornitina y glucosa.
• Sustratos secundarios: peptona, triptona
y extractos.
• Se siembra por picadura profunda

Este medio se usa para la identificación de enterobacterias
en base a su movilidad, producción de indol y actividad de ornitina
descarboxilasa.
El aminoácido ornitina es descarboxilado por la enzima
ornitina descraboxilasa para producir la diamina putrescina y CO 2,
implicando una alcalinización del medio.
La motilidad se demuestra por un enturbamiento del medio o
un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación. Los
cultivos no móviles no muestran este crecimiento difuso, sino que
más bien crecen a lo largo de la línea de inoculación.
La prueba del indol se basa e la eacción que s eproduce con
el rvo de Kovacs.

M: negativa
I: positivo
O: negativo
Ej.: Klebsiella oxytoca

M: positiva
I: negativo
O: positiva
Ej: Enterobacter aerogenes

M: positiva
I: positivo
O: positivo

Prueba de la Catalasa o
Peroxidasa
La catalasa es una enzima respiratoria presente en las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas que descomponen
el H2O2 que se forma como producto final del metabolismo de
los carbohidratos, que reacciona y forma H2O y O2.
En los tubos con la bacteria desarrollada se le vierte 2
gotas de H2O2 y si inmediatamente se forman burbujas se
anota que la prueba es +; de no existir burbujas, la prueba es
negativa.
Esta prueba sirve para diferenciar cultivos de
Streptococcus y Staphylococcus, ya que el Staphylococcus es
catalasa + y el Streptococcus es catalasa - . Del mismo modo
sucede con Bacillus que es catalasa + y Clostridium que es -

Prueba de la Catalasa o
Peroxidasa

Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es una enzima semejante a la protrombina,
producida por más del 96% de Staphyloccocus patógenos. La
coagulasa libre es liberada por la bacteria en el medio que la
rodea, siendo su determinación realizada en tubos. El “clumping
factor “ está fijado a la bacteria y depende de una sustancia de
la membrana microbiana, que se combina con el fibrinógeno del
plasma y favorece la aglomeración de Staphylococcus,
realizándose en un portaobjetos.
Generalmente la coagulasa libre y el clumpling factor
coexisten en las cepas patógenas.


Coagulasa +

Coagulasa -

1.- Determinación de la coagulasa libre
Se hacen subcultivos a partir de cepas seleccionadas en
caldo Infusión Cerebro-Corazón y se deja incubando a 37ºC 24h.
Añadir 0,1ml del cultivo a 0,3ml de plasma y dejar incubando a
37ºC. A las 4h examinar los tubos para ver si el medio aparece
coagulado, si es negativo, se examina hasta las 24h.
Interpretación:
• Negativo: Ningún signo de formación de fibrina
• Positivo:
- 1+: Presencia de pequeños coágulos organizados

- 2+: pequeño o pequeños coágulos organizados.
- 3+: gran coágulo organizado.
- 4+: todo el contenido aparece coagulado.
2.- Determinación del “clumping factor”
Se colocan sobre un portaobjetos 2 gotas de SSF
estéril y en ella se homogeniza la cepa con un asa. Dejar caer
una gota de plasma y homogenizar durante 15 a 20”, en este
período de tiempo, se observará que si los Sthaphylococus se
agrupan rápidamente son coagulasa + y si la cepa permanece sin
cambios es coagulasa -.

Prueba de la Citocromo Oxidasa
La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un
sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo
que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o
peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.
La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para
identificar todas las especies de Neisseria (+)y diferenciar
Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias.
El reactivo más recomendado para esta prueba es el rvo
de Kovacs, ya que es menos tóxico y más sensible que el rvo de
Gordon y Mc Leod. Este reactivo tiñe las colonias oxidasa
positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpuranegruzco intenso.

Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a
algunas colonias. No inundar toda la placa y no
invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo
de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15
segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es
dentro de los 10-30 minutos.

Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm
aproximadamente en una placa de Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro
del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre
el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10
segundos.

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