Este manual presenta 11 prácticas de laboratorio para familiarizar a los estudiantes de Medicina Veterinaria con los procedimientos básicos de cultivo y observación de bacterias y hongos. Incluye instrucciones sobre técnicas de esterilización, preparación de medios de cultivo, aislamiento bacteriano, tinción de frotis, toma y envío de muestras, y cultivo y identificación de diversos microorganismos. El objetivo es que los estudiantes aprendan a procesar muestras de casos clínicos y a integr

1. MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA Y
MICOLOGÍA VETERINARIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA-UABJO
pagina
Presentación ………………………………………………….. 2
Reglas de laboratorio …………………………………………. 3
practica 1 Técnicas de esterilización en bacteriología………… .5
Practica 2 Principales medios de cultivo y su preparación……. 9
Práctica 3 Técnicas de aislamiento bacteriano………………….12
Práctica 4 Preparación de frotis y tinciones …………………….. 20
Práctica 5 Toma y envío de muestras. …………………………. .24
Práctica 6 Cocos y bacilos gram positivos aerobios……………..28
Practica 7 Enterobacterias …………………………………………31
Práctica 8 Bacilos gram negativos no fermentadores……………33
Práctica 9 Bacilos gram positivos esporulados……………………35
Práctica 10 Prueba de sensibilidad antimicrobiana……………. 37
Práctica 11 Observacion y cultivo de hongos dermatofitos………40
Bibliografia……………………………………………………………. 43
1

2. Presentación: La microbiología es una ciencia relativamente reciente
comparado con otras ciencias; El estudio de los microorganismos se inició a partir
de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio y que partir de
estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el desarrollo y reconocimiento de los
microorganismos como actores de una gran variedad de procesos. Durante mucho
tiempo, estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en
plantas, animales y humanos; sin embargo también se han utilizado en diferentes
procesos industriales desde la antigüedad como en la producción de quesos, vino,
pan y cerveza. Actualmente se reconoce su importancia en diversas áreas de la
investigación básica, en la industria de alimentos, ambiental y farmacéutica. La
materia de bacteriología y micología se encuentra ubicada en el 3er semestre de
la carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, ubicada dentro de las materias
intermedias o médicas.
Este manual está dirigido a fortalecer el conocimiento que adquieras durante la
formación teórica como estudiante de Medicina Veterinaria en el área de
bacteriología.
El propósito de este manual es proporcionar una guía general para el trabajo de
laboratorio mediante una serie de prácticas que contemplan la forma adecuada de
tomar y enviar muestras al laboratorio de bacteriología que favorezcan al éxito de
su diagnóstico clínico, hasta las técnicas básicas y principios generales de
diagnóstico.
Este Manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que te familiarices
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacterias.
En cada práctica se presenta el propósito de la realización del ejercicio y una
breve introducción para facilitar la compresión de los mismos, después se indican
los materiales necesarios y procedimientos a realizarse
Competencias profesionales: Al término del curso serás competente para:
Colectar y conservar muestras de problemas clínicos de animales utilizando los
diferentes métodos de toma de muestra en forma adecuada, a partir de los
diferentes procesos patológicos para enviar al laboratorio de bacteriología.
Aprenderá que la coordinación de una adecuada toma y envío de muestra
repercute en la integración del diagnóstico clínico. Procesar las muestras recibidas
en el laboratorio de diagnóstico de bacteriología para determinar la presencia de
bacterias a partir de casos clínicos de diferentes sistemas del animal, además de
determinar cuales podrían ser de flora normal y cuales de un proceso patológico.
Identificar los géneros y especies a partir de evaluación del metabolismo
bacteriano por el uso de pruebas bioquímicas. Integrar el diagnóstico clínico en
base al resultado obtenido en el estudio bacteriológico. Seleccionar el tratamiento
adecuado por el uso de antibióticos cuando hayas evaluado diferentes drogas
contra el agente etiológico causante de la enfermedad. Prevenir la resistencia a
los antimicrobianos cuando seleccione adecuadamente la droga que usaras para
el tratamiento de los animales enfermos. Apoyar con calidad, en forma ética y
responsable la promoción en salud, la prevención de la enfermedad, diagnóstico y
2

3. vigilancia epidemiológica, contribuyendo así a la solución de la problemática de
salud a nivel local, regional y nacional.
Se recomienda realizar visitas a laboratorios de bacteriología en otras escuelas o
facultades para conocer las metodologías de trabajo, y evitar la endogamia
académica.
Este manual se actualizara de acuerdo a los recursos adquiridos y necesidades
propias de la escuela.
Reglas del laboratorio:
1. Durante las sesiones, siempre deberás usar una bata de laboratorio bien
abotonada, que deberás quitarte antes de abandonar el laboratorio.
2. No deberás sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.
3. Evitaras acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con
la práctica del laboratorio.
4. Colocarás todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona
especificada por el profesor.
5. No deberás ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del
laboratorio.
6. Se prohíbe fumar, tocarse la cara con las manos o algún otro objeto.
7. Deberás lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del
laboratorio, aun sea por breves periodos.
8. No se permitirán visitar personales que distraigan la atención y pongan en
riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.
Procedimiento del laboratorio:
1. Antes y después de cada sesión práctica, deberás limpiar las mesas de trabajo
con el desinfectante que se te proporcionará para este fin.
2. Cuando utilices mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros
equipos así como de tus cuadernos o prendar de vestir.
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4. 3. Al concluir cada sesión deberás asegurarte de que los materiales de desecho u
objetos contaminados los hayas colocado en los recipientes específicos para ello.
4. Deberás dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados.
5. En caso de producirse un incidente, deberás notificar al profesor de inmediato.
6. En el caso de derrame de algún cultivo o rotura de recipientes, deberás
conservar la calma, notificar al profesor y realizar el siguiente procedimiento: a)
Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar dispersión; b)
Poner abundante solución de desinfección sobre el área contaminada y c) Dejar
transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculos
destinado para la eliminación de material contaminado.
Materiales indispensables para cada sesión de laboratorio:
1. Bata de laboratorio limpia y con botones.
2. El protocolo de la práctica.
3. Un pedazo de tela absorbente sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar,
marcador indeleble o etiquetas pequeñas.
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5. PRÁCTICA No. 1
TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN EN BACTERIOLOGÍA
INTRODUCCIÓN
Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento
microbiano, como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más
ampliamente usado es el calor, ya sea húmedo ó seco, los cuales tienen diferente
penetrabilidad.
El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal
bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y
substancias, con el propósito de matar a las bacterias que ellos contengan.
Este proceso se llama “Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo
sometido a éste, se le denomina entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda
forma viviente.
Cuando se efectúa experimentalmente la esterilización de una población
microbiana, contenida en un medio de cultivo ó en todo el material utilizado en
bacteriología es de suma importancia conocer los diversos métodos de
esterilización los cuales se dividen en:
1).Métodos físicos tales como: calor, rayos ultravioleta, filtración, etc.
2).Métodos químicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o
bacteriostáticos como son alcoholes, fenoles, halógenos, detergentes, entre otros.
La elección del método de esterilización depende del tipo de material a esterilizar,
así como la finalidad que se persiga.
La esterilización por calor es uno de los métodos más comúnmente utilizados en el
laboratorio, es muy útil para la cristalería, los medios de cultivo y para la
esterilización de los medios después de su utilización y este puede ser:
a) Calor Húmedo
b) Calor Seco
c) Calor Directo
a) Calor Húmedo
Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilización se hace por el vapor a
presión en una autoclave (Chamberland) u olla de presión.
b) Calor Seco
La esterilización se hace por medio de un horno que permite alcanzar
temperaturas más elevadas (150- 180° que no puede n soportar los medios de
C)
cultivo y el material de goma ó plástico, se utiliza más para la esterilización del
material de vidrio (matraces, pipetas, cajas de petri, etc.) y en los instrumentos.
5

6. c) Calor Directo
Se utiliza en asas bacteriológicas y agujas de inoculación. La esterilización se
efectúa directamente en la flama del mechero.
La esterilización adecuada del material es importante para obtener los resultados
esperados.
OBJETIVO
1. Conocer y aplicar las técnicas de esterilización utilizadas en bacteriología, así
como comprender la importancia de este proceso.
MATERIALES
- Medios de cultivo: SIM, caldo nutritivo, agar sangre, agar nutritivo, etc.
- Alcohol ó fenol
- Cajas de petri
- Tubos de ensaye
- Pipetas
- Matraz Erlenmeyer
- Asas y aguja de siembra
-portacajas petri para esterilizar
-Pipeteros para esterilizar.
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7. - Autoclave u olla de presión
- Horno de esterilización
- Papel estrasa blanco o papel kraft
- Algodón plizado y rollo de gasa
-cinta testigo
METODOLOGÍA
a) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN DE CALOR HÚMEDO
Se utiliza principalmente la autoclave ó la olla de presión, es útil para medios de
cultivo.
AUTOCLAVE
1.- Lavar el material de vidrio (matraces) hasta dejarlos perfectamente limpios y
libres de sales, para lo cual se lavan y después se les da un enjuague final con
agua destilada.
2.- Colocar el ó los medios de cultivo ya preparados (de acuerdo a las indicaciones
del frasco) en los matraces ó tubos de ensaye antes de su esterilización.
3.- Tapar el material de vidrio ya sea con sus tapaderas o fabricarlas con algodón
ó gasa.
4.- Depositar el material en la cubeta de la autoclave, cuidando de colocar un
capuchón de papel aluminio en el cuello del material.
5.- Vaciar el agua destilada en la autoclave hasta donde indica la marca del nivel.
6.- Cerrar la tapa cuidando de apretar los pernos como lo indique el instructor.
7.- Encender y girar el reóstato (botón) en la posición “alto”.
8.- Cuando el agua contenida dentro de la autoclave hierve, el vapor elimina el aire
de la autoclave, el escape del vapor por la espitia (que estará abierta) es irregular.
Un chorro continuo indica la eliminación completa del aire, con lo que se procede a
cerrar la espitia, la temperatura y la presión suben enseguida.
9.- Cuando se ha obtenido la temperatura deseada de 121° que corresponde a 1
C
Kg. de presión, girar el botón en la posición de “medio” lo cual nos permite
conservar la temperatura y la presión deseada por un tiempo determinado de
121° por 15 minutos a 1 Kg. de presión.
C
10.- Trascurridos los 15 minutos se coloca el reóstato en la posición de “OFF”
(apagado), el manómetro indicará un descenso en la presión.
11.- Cuando la presión es nula, se abre la espitia de escape de vapor, penetrando
el aire al aparato. Solamente entonces puede abrirse la tapadera y retirar los
objetos húmedos ya esterilizados.
b) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
1.- El material de vidrio debe encontrarse limpio y libre de sales.
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8. 2.- Se procede a tapar el material ya sea con sus tapaderas ó fabricarlas con
algodón ó gasa.
3.- Envolver en papel y llevarlo al horno (evitando el contacto con las paredes del
horno), las extremidades de los objetos que llevan algodón ó papel deben
colocarse hacia arriba.
4.- Encender y controlar la calidad de la flama si el calentamiento es con gas.
5.- Para tubos de vidrio, pipetas (por separado) y cristalería en general, utilizar
170° por espacio de 1 hora.
C
6.- Transcurrido el tiempo de esterilización se apaga el horno y se deja enfriar para
sacar el material.
NOTA: Los pipeteros requieren de un tiempo de 2 horas.
c) TÉCNICA DE ESTERILIZACIÓN CON CALOR DIRECTO
Se utiliza para asas bacteriológicas y agujas de inoculación.
1.- Estas se deben esterilizar antes y después de llevar acabo la siembra de
cualquier tipo de bacteria.
2.- Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante algunos
segundos.
3.- Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfría en las paredes
inferiores del recipiente de cultivo.
8

9. PRÁCTICA No. 2
PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACIÓN
INTRODUCCIÓN
El estudio adecuado de las bacterias, exige como requisito previo, poder
cultivarlas en condiciones de laboratorio. Para lograr esto, es preciso conocer, los
elementos nutritivos para la obtención de energía que será empleada para la
biosíntesis y la reproducción celular y las condiciones físicas. Las exigencias
nutritivas de las bacterias se han establecido después de dilatadas
investigaciones, cuyos resultados han sido el desarrollo de numerosos medios de
cultivo artificiales, estas necesidades nutritivas son muy diversas, debido a ello
existen grandes diferencias.
Los medios de cultivo más comunes utilizados son los que están constituidos con
peptonas, extractos de carne o carne parcialmente digerida y extractos de
levadura llamados también medios básales.
Cuando hay que utilizar medios sólidos, se agregan agar a los medios líquidos,
como agente coagulante o solidificante. La preparación de los medios de cultivo,
ha sido reemplazada en gran medida por el uso de medios de cultivo
deshidratados a los cuales se les agrega agua destilada, tales medios son
estables y bien estandarizados con respecto a pH y concentración de materiales.
Según el propósito para lo que son fabricados los medios de cultivo se pueden
clasificar en:
a) Medios básales, básicos o generales: Son medios simples que contienen en
general los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos
poco exigentes nutricionalmente in vitro, ejemplo: agar nutritivo (A.N.), caldo
nutritivo (C.N.), agar soya triptosa (T.A.S.), caldo soya tripticasa (T.C.S.) y caldo
cerebro corazón (B.H.I.).
b) Medios enriquecidos: Son medios que han sido complementados con otros
nutrientes que proporcionan factores de crecimiento y cuya finalidad es promover
el desarrollo de microorganismos de requerimiento nutricional más exigentes,
ejemplo: gelosa sangre (G.S.), gelosa chocolate (G.CH.).
c) Medios selectivos o inhibitorios: Cuando una muestra contiene gran cantidad de
microorganismos, su crecimiento puede ser excesivo por lo que es necesario
suprimir su desarrollo y al mismo tiempo promover y/o seleccionar el crecimiento
de los microorganismos de interés que pudieran encontrarse en dicha muestra,
ejemplo: agar verde brillante (A.V.B.), agar salmonella –shigella (S.S).
d) Medios diferenciales, ejemplo: pruebas bioquímicas.
e) Medios de enriquecimiento utilizados en bacteriología del tracto intestinal son:
caldo selenito, etc.
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10. f) Medios de transporte, sirve para mantener varios microorganismos por un lapso
corto de tiempo, ejemplo: cary-blair, Stuart.
OBJETIVO
1. Conocer y preparar los medios de cultivo más comunes empleados en
bacteriología
MATERIALES
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo
- E.M.B.
- Agar(S-110)
- Medio SIM
- medio Mc Conkey
-agar sangre
-Agua destilada
- Cajas de Petri esterilizadas
- Tubos de ensaye
- Matraces Erlenmeyer
- Probetas.
- Balanza granataria
- papel aluminio
-Algodón ó gasa estéril
- Marcador permanente
-cerillos
-cinta testigo
-papel estrasa
- sangre de bovino o borrego estéril
-bolsa para unidad de sangre 250 ml
METODOLOGÍA
1.- Preparar 75 ml. o lo que indique su instructor o de agar nutritivo como lo señala
el frasco, esterilizar a 121° por 15 min en autocl ave u olla de presión. Vaciar el
C
medio en cajas de petri esterilizadas, dejar solidificar. Marcar las cajas con lápiz
graso.
2.- Preparar 70 ml. de agar (S-110) como lo indica el frasco, vaciar en cajas de
Petri estériles marcadas.
3.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de E.M.B. según
especificaciones del frasco, esterilizar, dejar enfriar un poco, vaciar en cajas de
petri estériles y marcar las cajas.
4.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio SIM según
especificaciones del frasco, esterilizar y vaciar en tubos de ensaye.
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11. 5.- Preparar 50 ml. de caldo nutritivo como lo indica el frasco, distribuirlo en tubos
de ensaye (3 ml. c/u) esterilizar a 121 ° por 15 m inutos.
C
6.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio Agar
nutritivo según especificaciones del frasco, distribuirlo en tubos de ensaye (6 ml
cada uno), esterilizar y dejarlos enfriar en superficie inclinada.
7. preparar 75 ml de agar sangre como lo señala el frasco,, esterilizar a 121◦C, por
15 min en autoclave. Enfriar el medio a 45 0C y agregar el 10% de sangre, y
vaciar en cajas de Petri esterilizadas y dejar solidificar.
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12. PRÁCTICA No 3
TÉCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO
INTRODUCCIÓN
Una técnica muy común en el laboratorio de microbiología es la transferencia de
microbios de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Es necesario
tomar las debidas precauciones para evitar la contaminación de los cultivos.
Para el estudio e identificación de microorganismos éstos deben aislarse o
separarse a partir de un cultivo mixto o de poblaciones que se encuentran en la
naturaleza. Existen varias técnicas para el aislamiento de microorganismos y la
obtención de cultivos puros, dentro de las más utilizadas se encuentran:
a) Siembra por estrías en caja de Petri o tubo de ensaye.
b) Vaciado en placa donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en
partes profundas del medio inoculado.
c) Cultivo por dilución y agitación.
d) Aislamiento de bacterias con una varilla angular de vidrio.
e) Aislamiento de microbios extraídos con un aplicador de algodón.
f) Siembra por picadura, etc.
Después de que una población de microorganismos ha estado creciendo por cierto
tiempo en el mismo tubo de ensaye o caja de Petri, debe ser transferido a un
medio de cultivo nuevo para que pueda continuar su crecimiento y supervivencia.
OBJETIVO
1. Aprender las técnicas fundamentales empleadas para la transferencia y
aislamiento de microorganismos.
MATERIALES
-Tubos de ensaye con caldo nutritivo
-Tubos de ensaye con agar nutritivo (superficie inclinada)
- Cajas de Petri con agar EMB
-Tubos de ensaye con medio SIM (superficie horizontal)
-Cajas de Petri con agar nutritivo
-Tubos de ensaye con S-110
-Asa y aguja de inocular
-Mechero
-Algodón
-cinta testigo
-Kleen pack
-Muestra mixta
Cultivos:
-Bacillus subtilis
-Escherichia coli
-Staphylococcus aureus
-Pseudomonas aeruginosa
-Proteus vulgaris
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13. Técnica aséptica:
1.-Limpiar perfectamente la mesa de trabajo con alcohol, flamearla con el
mechero.
2.- Lavarse las manos con jabón y después frotárselas con un algodón con
alcohol.
3.-Colocar los tubos y demás material en una posición adecuada en la que se
puedan alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse.
4.- Trabajar siempre junto al mechero, ya que este proporciona una zona de
esterilidad de aproximadamente 20 cm. de radio.
5.- Antes de realizar cualquier siembra, esterilizar el asa o aguja a fuego directo
hasta el rojo vivo, enfriar cerca del mechero, sembrar y volver a esterilizar.
6.- Durante la siembra, deben permanecer cerradas las puertas y ventanas y no se
debe hablar.
Técnicas de sembrado.
1.- Inoculación de medios líquidos:
a) Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y otro con caldo nutritivo
estéril.
b) Con la otra mano, tomar el asa y esterilizarla hasta el rojo vivo. Quitar los
tapones de los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, tener
cuidado de no acercarlo demasiado al mechero.
c) Flamear los bordes de ambos tubos, introducir el asa al cultivo y tomar una
pequeña muestra sin rasgar el medio.
d) Introducir el inóculo dentro del tubo con el caldo y agitar el asa.
e) Retirar el asa, flamear nuevamente los bordes de los tubos y colocar los
tapones.
f) Esterilizar el asa.
g) Etiquetar el tubo inoculado (medio de cultivo empleado, microorganismo
inoculado, número de equipo, sección y fecha)
h) Guardar a temperatura ambiente.
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14. Método correcto de la inoculación con el asa en medio líquido.
2.-Inoculación en medio inclinado
a) Tomar un tubo que contenga el cultivo y otro con el medio inclinado.
b) Sujetar los tubos, remover los tapones y realizar los pasos asépticos como se
explicó anteriormente.
c) Esterilizar el asa y tomar un inóculo del medio de cultivo.
d) Introducir el asa hasta el fondo del tubo y deslizarla a manera de estrías sobre
la superficie del medio hasta el extremo externo, sin repetir la operación.
e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar el asa.
g) Etiquetar el tubo inoculado.
h) Incubar.
14

15. Siembra en medio sólido inclinado
3. Cultivo por picadura:
a) Tomar el tubo que contenga el cultivo y otro con medio de cultivo SIM.
b) Realizar los pasos de flameado y remoción de tapones.
c) Esterilizar la aguja y tomar una muestra de cultivo
d) Introducir la aguja en el medio sin llegar al fondo del tubo, sacarla por el mismo
trayecto de la entrada sin repetir la operación.
15

16. e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.
f) Esterilizar la aguja.
g) Etiquetar el tubo.
h) Incubar.
4. Siembra por estrías en caja de Petri
Aislamiento primario de bacterias:
Todo el proceso se realizará en zona estéril, junto al mechero y abriendo la caja
sólo que sea necesario. Los pasos son los siguientes:
a) Esterilizar el asa de siembra y tomar una asada de la muestra mixta.
b) Tomar la caja de Petri, reposarla sobre la palma de la mano, abrir la tapa con el
pulgar y el dedo medio.
c) Colocar el inóculo en el borde del agar y hacer una estría inicial sin despegar el
asa, presionando, pero sin perforar el agar, hasta cubrir aproximadamente una
cuarta parte de la caja como se indica en la figura 12.
d) Bajar la tapa de la caja y esterilizar el asa.
e) Girar la caja de petri un cuarto de vuelta, levantar la tapa, enfriar el asa tocando
la superficie de agar, lejos de la estría recién hecha.
f) Tocar una vez más la superficie de la estría recién hecha con el asa y hacer un
segundo grupo de estrías. Tener cuidado de no cruzar ninguna de las estrías
originales.
g) Tapar la caja y repetir los paso d, e y f
h) Sellar la caja con kleen pack
i) Marcar con lápiz graso la caja (medio de cultivo utilizado, muestra empleada,
No. de equipo, sección y fecha)
j) Incubar la caja de manera invertida.
Si se trata de un cultivo puro, se puede sembrar por estrías en un tubo de ensaye
con superficie inclinada o bien en una caja de petri realizando únicamente una
estría en toda la superficie.
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17. Método de aislamiento por siembra por estría en placa. Para obtener un cultivo
axénico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero,
(b) introducirla en la suspensión bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar
haciendo estrías sobre la superficie de un medio sólido en una placa Petri, y (d)
volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un
segundo grupo de estrías en una región nueva de la placa. Repetir el proceso una
tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de células se diluyan y
se separen células aisladas. (e) Después de la incubación, se desarrollan colonias
aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero;
para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estrías una segunda placa.
Algunos de los diseños que se pueden dibujar sobre el agar al inocular una caja
de petri
17

18. Características de los cultivos de bacterias
18

19. 5.- Aislamiento de microbios extraídos con un aplicador de algodón
a) Introducir el aplicador de algodón a un cultivo mixto.
b) Trazar con el algodón unas líneas inoculando una pequeña zona en el borde de
una caja de Petri con agar nutritivo.
c) Cubrir la caja, sumergir el aplicador en solución desinfectante, para
posteriormente esterilizarlo.
d) Esterilizar el asa y pasarla al sector inoculado con el algodón, realizando estrías
por cuadrantes.
e) Esterilizar el asa, invertir la caja e incubar.
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20. PRÁCTICA No. 4
PREPARACIÓN DE FROTIS Y TINCIONES
INTRODUCCIÓN
Dado que por lo general las bacterias no tienen pigmentos y son incoloras en
estado natural en su forma real. Algunos investigadores como Robert Koch, Paul
Erlich y otros vencieron esta dificultad usando métodos de fijación (preparación de
frotis) y tinción de bacterias ya que es necesario teñirlas para poder observar su
morfología así como también poner de manifiesto algunas características de su
estructura.
Los métodos de tinción pueden ser simples o diferenciales.
a) Tinciones Simples: son aquellas en las que solo se utiliza un colorante ya que
muchas bacterias tienen material ácido (RNA o DNA) distribuido en su célula, por
lo que se colorea intensamente con colorantes básicos estos son colorantes
nucleares ejemplo: fucsina básica, cristal violeta, azul de metileno entre otras.
b) Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se utilizan dos o más
colorantes que ponen de manifiesto alguna(s) estructura (s) o un tipo de células se
tiñen de un color y el resto de otro.
El método de tinción más utilizado es el de la tinción del Gram., ya que es la
coloración más importante para bacterias fue ideada por Hans Cristian Gram en
1884, permitió distinguir entre varias especies de bacterias que pueden presentar
morfología colonial similar.
Cuando las bacterias retienen la combinación cristal violeta-iodo y se tiñe de
violeta, son bacterias gram (+), las bacterias que se tiñan de rojo por la safranina
son gram negativas.
Las células bacterianas gram (+) se les adhiere el cristal violeta, porque hay
disminución de la permeabilidad de la pared celular causada por el efecto
deshidratante del alcohol, mientras que las gram (-) el complejo sale por el
aumento de la permeabilidad causada por la solubilidad de los lípidos de la pared
celular al alcohol.
Existen también bacterias gram variables (Nisseria spp) y bacterias gram no
reactivas (Mycobacterium spp) otros ejemplos de tinciones diferenciales son: la
tinción ácido-alcohol-resistente (utilizada para diferenciar bacterias del género
Mycobacterium de otros tipos) y la tinción de endosporas.
OBJETIVOS
1. Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias.
2. Conocer los métodos de tinciones, aprender a realizar la técnica de tinción
simple usada en bacteriología.
20

21. 3. Conocer y distinguir que es tinción diferencial así como aplicar la técnica de
Tinción de Gram.
MATERIALES
- Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis
- Azul de metileno
- Cristal violeta 0.1% en solución acuosa
- Yodo lugol
- Alcohol-cetona (1:1)
- Safranina
- Aplicador estéril (sí el instructor lo cree necesario).
- Agua destilada
- Aceite de inmersión
- Papel seda
- Asa bacteriológica
- Marcador permanente
- Alcohol y algodón para limpiar su mesa
- Goteros y micro pipeta
- Mecheros
- Portaobjetos
- Microscopio compuesto
- solucion de cloro(desinfectante)
KOH al 3%
a) Preparación de Frotis y Fijado
1. - limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizará el frotis, dejarlo secar,
una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces.
2.- Cuando este frió, marcar la cara donde se hará el frotis.
3.- Calentar el asa de inoculación hasta que este al rojo
4.-. Tomar el cultivo del que se hará el frotis y flamear la boca de este. Tomar la
porción de la muestra que se va a examinar por medio de un asa o escobillón.
5.- Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente
marcado
***Si la muestra se encuentra en un medio líquido, basta con colocar una pequeña
gota con el asa estéril sobre el portaobjetos.
***Si la muestra está en un medio sólido, colocar una gotita de solución salina o
agua destilada estéril sobre el portaobjetos y con el asa estéril se transfiere una
pequeña muestra de bacterias en la gotita.
6.- Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda con el asa
la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire.
7.- Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.
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22. 8.- Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10 min o hasta que
seque completamente.
9.- Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero, pasándolo tres veces
a través de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo
sobre el dorso de la mano.
b) Tinción Simple
1.- Cubra el frotis (B. subtilis) con la solución de azul de metileno durante 2
minutos.
a) Lave el portaobjetos, con una corriente suave de agua,
de manera que el agua no incida directamente sobre la
preparación hasta que ya no escurra colorante.
b) Deje secar el frotis al aire.
c) Observar al microscopio con el objetivo de 100X.
A) Tinción de Gram.
Consta de cuatro reactivos diferentes: el cristal violeta es el primer colorante o
colorante primario que imparte color a todos los microorganismos del frotis.
Enseguida se utiliza una solución del yodo (lugol), la que actúa como mordente
(que aumenta o refuerza la unión, entre un colorante y un sustrato ), el tercer
reactivo es un decolorante que disuelve y arrastra el colorante primario, los
organismos que resisten la decoloración y conserva una tonalidad azul son Gram
(7), el cuarto reactivo es el colorante de contraste la safranina que se aplica como
contra tinción ya que los organismos se destiñeron con el decolorante, ahora
toman el color rojo de la safranina denominándose gram (-).
PASOS A SEGUIR EN LA TÉCNICA DE GRAM
1.- Preparar los frotis como en la técnica de tinciones simples. Y preparación de
frotis y fijado.
2.- Preparar los frotis con cultivos de S. epidermis, E. coli.
3.- Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
5.- Cubrir los frotis con yodo – lugol durante 1 minuto.
6.- Lavar como se indicó en el paso (4).
7.- Decolorar con alcohol-acetona hasta que no escurra líquido azul.
8.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).
9.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.
10.- Lavar como en el paso (4).
22

23. 11.- Observar al microscopio a inmersión. OB (100 X). Ver figura Tinción Gram
Al finalizar el proceso de Tinción de Gram, las bacterias gram-positivas se tiñen de
color púrpura-violeta y las bacterias gram-negativas se tiñen de color rojizo-rosado
23

24. PRACTICA No 5
Toma y envío de muestras
Introducción: La bacteriología y micología diagnóstica es el estudio de las
muestras tomadas a partir de pacientes de los cuales se sospecha de una
infección que involucre a estos agentes. El laboratorio puede apoyar al clínico de
la siguiente manera: Confirmando el diagnóstico presuntivo, sugiriendo la
quimioterapia de la enfermedad y colaborando en el conocimiento epidemiológico
de la enfermedad. Los resultados y rapidez del análisis bacteriológico, no solo
dependen de los métodos del laboratorio; en gran medida dependen de la forma
de colección, conservación y envío de la muestra. Los resultados pueden ser
influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la flora
normal, por la migración bacteriana pos-mortem o por la aplicación de
antimicrobianos antes del envío de la muestra. El MVZ clínico, debe de considerar
estos factores para interpretar los resultados emitidos por el laboratorio.
Los problemas más frecuentes para la identificación bacteriana y micológica son:
1. Falta de una historia clínica completa y de un diagnóstico presuntivo.
2. Envío de muestras no representativas de la lesión.
3. Toma de muestra en condiciones no asépticas.
4. Muestras inadecuadas como sangre hemolizada, suero turbio contaminado,
orina de mas de 4 horas de haber sido tomada, hisopos son medio de transporte,
muestras no refrigeradas, etc.
Propósito específico de la práctica: Con el desarrollo de esta práctica obtendrás
la capacidad para colectar, conservar y enviar muestras clínicas al laboratorio para
el aislamiento e identificación de bacterias y hongos.
24

25. Desarrollo de la práctica:
1. Recopilarás los datos mas importantes para realizar la historia clínica.
2. Tomarás muestras de exudado, leche sangre, heces, orina, órganos y pelo de
animales que presenten problemas clínicos.
3. Rotularás la muestra tomada con marcador indeleble.
4. Conservarás y llevarás las muestras al laboratorio de bacteriológico para su
análisis.
Para el desarrollo de la práctica es necesario que siempre uses material y equipo
para salvaguardar tu seguridad sanitaria, por lo que no debes de olvidad usar
overol, botas y guantes cada vez que trabajes con animales. Para tener una
adecuada forma de tomar la muestra se debe apegas a ciertas normas como:
1. Tomar la muestra del sitio anatómico más representativo del problema, de
preferencia en la etapa aguada de la enfermedad.
2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos deberán de tomarse
dentro de las primeras tres horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.
3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de antisepsia, como
limpiar la piel con alcohol al 70% y aplicar yodo al 1% por 1 minuto.
4. El material de colección y el recipiente donde se trasportará la muestra debe ser
estéril.
5. Las muestras colectadas no deben de estar en contacto con desinfectantes.
6. Las muestras deben estar identificadas con los siguientes datos: especie, raza,
edad, sexo, arete o nombre del animal; dirección, teléfono y nombre del propietario
del animal.
7. Una vez colectadas la muestras deben de enviarse dentro de las siguientes 4 –
24 horas al laboratorio en condiciones de refrigeración (4° esto se logra usando
C);
hielo o refrigerantes en cajas de poliuretano.
8. En el caso de uso de hisopos para la toma demuestras de exudados, deberán
de enviarse en medio de transporte como el Stuart, Carry-Blair, etc. Que contienen
componentes como péptidos, azúcares, aminoácidos, etc. Que permiten
perseverar las bacterias pero evitando su multiplicación.
25

26. 9. Debe de anexarse una historia clínica pertinente que incluya el número de
animales afectados, si la muestra proviene de un animal tratado con
antimicrobianos, cuales y durante cuanto tiempo y un diagnóstico presuntivo con
base a signos clínicos y epidemiológicos.
10. Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clínicas deben de
realizarse con precaución debido a que algunos agentes involucrados en las
enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis para la
salud del clínico y del bacteriólogo.
NOTA: Si no se toman en consideración estas normas, el laboratorio podrá
rechazar la muestra para el análisis bacteriológico y micológico. Si continuas con
estas recomendaciones, al término de la sesión de prácticas serás competente
para tomar muestras de procesos patológicos de casos clínicos de diferentes
sistemas del animal, además de conocer el manejo adecuado al remitir la muestra
al laboratorio. Con las habilidades adquiridas en esta sesión, estarás capacitado
para tener un apoyo en tu diagnóstico de campo. Aprenderás que la coordinación
de una adecuada toma de muestra repercute en la integración de tu diagnóstico
clínico.
Recursos: Material necesario
Torundas del algodón al 70%
Torundas de Yodo al 2%
Un tubo de medio de transporte por equipo
Un hisopo estéril por equipo
Dos frascos estériles por equipo
reactivo de california
*Overol y botas
*Un guante de palpación por persona
* Guante quirúrgico *
Tres tubos de vacutainer (tapón morado) por persona
*Tres bolsas de plástico pequeñas por equipo
*Un sobre de papel nuevo y pinzas por equipo.
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27. *Un lazo de media pulgada y 5 m por equipo. *
Una hielera con refrigerantes por equipo
. NOTA: * Este material debe ser traído por el alumno.
La práctica se realizará en los ranchos y comunidades circundantes a la escuela.
Recursos:
Material necesario
1. Muestra traída por el estudiante
2. Agar sangre
3. Agar Mac Conkey
4. Agar de Tripticasa Soya
5. Asa microbiológica
6. Reactivos para tinción de Gram
7. Porta objetos
8. Mechero
9. estufa bacteriológica
El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área
27

28. PRACTICA No 6
Cocos y bacilos Gram positivos aerobios
Introducción: En la microbiología el examen microscópico es generalmente el
primer paso que se da para la identificación de un organismo desconocido; pero el
tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resulta difícil ver con el
microscopio óptico, principalmente por la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea, por lo que se procede a hacer tinciones especiales para su
observación como la de Gram. Muchos de los géneros de cocos y bacilos Gram
positivos están involucrados en diferentes procesos piógenos en animales y el
hombre. Dentro de los cocos Gram positivos que de interés veterinario están los
Staphylococcus y Streptococcus. El género Staphylococcus comprende
microorganismos que están presentes en la mucosa y en la piel de los animales.
Los especies que se asocian con más frecuencia a las enfermedades son
Staphylococcus aureus, S.epidermidis, S. saprophticus, S. capitis y S.
haemolyticus. Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios
bacteriológicos, en condiciones aeróbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor
velocidad de crecimiento es a 5 - 25 ºC. Además, producen catalasa, lo que los
diferencia de los estreptococos. El género Streptococcus pertenece a este grupo
de los cocos Gram positivos; Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde
cada división celular ocurre a lo largo de un eje. Los Streptococci son oxidasa y
catalasa negativo. Las especies de estreptococus que producen enfermedades en
animales son: Streptococcus pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, S.
zooepidemicus, S. equisimilis, S. equi, S. faecalis, S. dysgalactiae, S. uberis.
Dentro de los bacilos piógenos podemos mencionar al género Corynebacterium;
es inmóvil, anaerobio facultativos, catalasa positiva. Las corinebacterias están
ampliamente distribuidas en la naturaleza encontrándose en el suelo, el agua,
productos alimenticios y también en la mucosa y piel de animales y del hombre.
Entre las especies de importancia veterinaria podemos citar a C. pyogenes, C.
renale, C. pseudotuberculosis, C. pillosum, C. suis, C. equi.
Propósito específico de la práctica: Conocerás las características morfológicas
de cultivo y bioquímicas mas relevantes de los géneros Staphylococcus spp,
Streptococcus spp y Corynebacterium spp, asociados a los diferentes procesos
patológicos en los animales domésticos. Comprenderás que las pruebas
bioquímicas dan evidencias de la actividad metabólica que puedes monitorear en
forma indirecta.
28

29. Desarrollo de la práctica:
1. Describe la morfología de las colonias de Staphylococcus spp., Streptococcus
spp. y Corynebacterium spp.
2. Observa la producción de hemolisinas en agar sangre de las bacterias
mencionadas.
3. Realice la tinción de Gram con las 3 especies bacterianas
4. . Compruebe la morfología, afinidad tintorial y agrupación bacteriana.
5. Realice la prueba de catalasa,oxidasa, O-F, tinsion acido alcohol resistente,
con los medios de cultivo proporcionados y anote el resultado.
6. Realice pruebas bioquímicas sembrando medios de urea, citrato, SIM, lactosa,
maltosa, manitol, glucosa, MR-VP e incube 24 horas a 37°
C.
7. Concluya la identificación en base a tablas de identificación.
pruebas bioquímicas complementarias: coagulasa, fermentación del manitol,
prueba de la desoxirribonucleasa, prueba de bacitracina, hidrólisis de hipurato de
sodio, tolerancia al cloruro de sodio, reacción bilis-esculina, prueba PYR, prueba
de CAMP, reducción de nitrato, hidrólisis de gelatina, fermentación de
carbohidratos, azucares: glucosa, lactosa,sacarosa, manitol, dulcitol, salicina,
adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, ramnosa, xilosa, trehalosa,
celobiosa, galactosa, inulina, fructuosa, melibiosa, maltosa.
Al terminar serás competente para determinar la presencia de bacterias a partir
de muestras tomadas de procesos piógenos, neumónicos y de mastitis de casos
clínicos de diferentes especies animales. Tendrás la capacidad de identificar los
géneros y especies a partir de evaluación del metabolismo bacteriano por el uso
de pruebas bioquímicas. Aprenderás a integrar el diagnóstico clínico en base a
una remisión de muestra al laboratorio diagnóstico.
Material necesario
los aislamientos se realizaran a partir de las muestras obtenidas de casos clínicos
de vacas con mastitis suclinicas y clínicas, abcesos, heridas infectadas, y órganos
con abcesos.
29

30. 1. Cultivo en agar sangre con Staphylococcus spp., Streptococcus spp. y
Corynebacterium spp.
2. Reactivos para tinción de Gram
3. Mechero
4. Cubreobjetos
5. microscopios ópticos
6. juegos de pruebas bioquímicas de urea, citrato, SIM, lactosa, maltosa, manitol,
glucosa, MR-VP , catalasa, O-F, acido a partir de Glucosa, oxidasa.
. El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área.
30

31. PRÁCTICA NO 7
ENTEROBACTERIAS
Introducción: Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que
contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología
de bacilos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del
intestino (llamados coliformes) y de otros órganos de otras especies animales.
Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuáticos.
Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. No
son exigentes, son de fácil cultivo, son oxidasa negativo, es decir, carecen de la
enzima citocromo oxidasa. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. Son
anaeróbicos facultativos. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones
anaeróbicas con o sin la producción de gas (en especial glucosa y lactosa) y
oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aeróbicas. Muchos
géneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos géneros no
son móviles. Entre las especies de importancia veterinaria podemos mencionar a
Escherichia spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp.,
Proteus spp. Propósito específico de la práctica: Conocerás las características
morfológicas de cultivo y bioquímicas más relevantes de las enterobacterias de
mayor importancia en Medicina Veterinaria.
Propósito específico de la práctica: Conocerás las características morfológicas de
cultivo y bioquímicas más relevantes de las enterobacterias de mayor importancia
en Medicina Veterinaria.
Desarrollo de la práctica:
1. Observa las placas de agar Mac Conkey, describe la morfología de colonias y
determina si son fermentadoras o no de la lactosa.
2. Realiza frotis fijos con los cultivos, tíñelos con Gram.
3. Observa la morfología, afinidad tintorial y agrupación.
4. Realice la prueba de oxidada para cada uno de los cultivos.
31

32. 5. Siembre las pruebas bioquímicas de TSI, urea, citrato, SIM con el cultivo que te
indique tu instructor. , RM-VP, LIA, MIO, CM, CS, CALDO ARGININA, CALDO
PEPTONADO,
6. Incube a 37° durante 24 horas.
C
7. Haga la lectura de las pruebas bioquímicas.
8. Concluya la identificación en base a las tablas que te proporcionara el instructor.
Al terminar la sesión serás competente para identificar la presencia de bacterias a
partir de muestras tomadas de procesos diarreicos de casos clínicos de diferentes
especies animales. Tendrás la capacidad de identificar los géneros y especies a
partir de evaluación del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas
bioquímicas. Aprenderás a integrar el diagnóstico clínico en base a una remisión
de muestra al laboratorio diagnóstico.
Recursos: Material necesario
1. Caja de agar Mac Conkey con cultivo de Proteus y E. coli
2. Porta objetos
3. Mechero
4. Reactivos
5. juegos de pruebas bioquímicas que incluya TSI, urea, citrato, SIM con el cultivo
que te indique tu instructor.
6. Reactivo para prueba de oxidasa.
El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área.
32

33. PRACTICA No 8
Bacilos Gram negativos no fermentadores
Introducción: Las bacterias no fermentadores están asociados principalmente a
procesos respiratorios. Este grupo de bacterias son principalmente Gram
negativas, oxidasa positiva, aerobios o anaerobios facultativos. Dentro de las
bacterias de este grupo están los géneros Pasteurella spp, Manhemia spp,
Haemophilus spp, Actinobacillus spp y Bordetella spp. Este grupo penden estar
como comensales de infecciones en animales. Para su crecimiento requieren de
medios enriquecidos con sangre, suero; el caso específico de Haemophilus spp,
requiere el factor X (hemina) o factor V (nicotinamida adenin dinucleótido NAD) o
ambos para su crecimiento. Las colonias se hacen visibles entre las 24 y 48 horas,
crecidas a 37°C.
Propósito específico de la práctica: Conocerás las características morfológicas
de cultivo y bioquímicas más relevantes de los géneros Pasteurella spp,
Manhemia spp, Haemophilus spp, Actinobacillus spp y Bordetella spp. Con este
conocimiento asociarás el hábitat con el metabolismo bioquímico de las bacterias
y su relación en la patogenia de la enfermedad.
Desarrollo de la práctica:
1. Con los cultivos de Pasteurella que se te proporcionarán, realiza un frotis y
tíñelo con Gram.
2. Observa la morfología y afinidad tintorial.
3. Realice la prueba de oxidasa con los cultivos.
4. Observa la hemolisis de Pasteurella en las cajas de petri de agar sangre.
5. Inocule los medios TSI y SIM con las colonias bacterianas.
6. Incube la prueba bioquímica por 24 horas a 37°
C
7. Concluya la identificación del microorganismo utilizando las tablas de pruebas
bioquímicas.
33

34. Al término de la sesión serás capaz de identificar la presencia de bacterias a partir
de muestras tomadas de infecciones del sistema respiratorio de casos clínicos de
diferentes especies animales. Tendrás la capacidad de identificar los géneros y
especies a partir de evaluación del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas
bioquímicas. Aprenderás a integrar el diagnóstico clínico en base a una remisión
de muestra al laboratorio diagnóstico
Material necesario
1. Cultivo de Pasteurella spp en agar sangre
2. Reactivos para tinción de Gram
3. Juego de pruebas bioquímicas para inocular: TSI y SIM
El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área.
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35. PRACTICA No. 9
Bacilos Gram positivos esporulados
Introducción: Dentro de los miles de géneros bacterianos, solo existen dos
capaces de inducir la formación de esporas; el Clortridium y el Bacillus. Las
esporas son estructuras densas en las que se transforman las bacterias para
resistir el calor o la desecación, y son muy resistentes a la acción de
desinfectantes. Cuando las condiciones vuelven a ser favorables, las esporas
germinan y dan lugar de nuevo a la bacteria en forma vegetativa. El
descubrimiento de que existen esporas bacterianas, fue de gran importancia para
la microbiología. El saber que existen tales formas notablemente termo resistente
fue esencial para el desarrollo de métodos adecuados de esterilización. Una
espora es capaz de permanecer en latencia por muchos años, pero puede
convertirse de nuevo en una célula vegetativa en cuestión de minutos. Clostridium
es un género de bacterias anaerobias, bacilos Gram positivas, parásitas y
saprófitas algunas de ellas; son móviles, en general por intermedio de flagelos
perítricos. En animales pueden estar involucradas en procesos nerviosos como el
tétanos y el botulismo y el sistema musculo esquelético como las miositis
clostidianas. El género Bacillus, son aerobios estrictos o anaerobios facultativos y
están involucrados en procesos de intoxicación alimentaria, sin embargo hay
algunas de gran interés veterinario como la inductora del Ántrax.
Propósito específico de la práctica: Conocerás las características morfológicas
de cultivo y bioquímicas más relevantes de los géneros Bacillus spp y Clostridium
spp. Conocerás las formas que adquieren las esporas en estos géneros
bacterianos. Asociarás la producción de esporas con la patogenia de las
enfermedades inducidas por estos géneros bacterianos
Desarrollo de la práctica:
1. Observe el desarrollo de las colonias en agar sangre del Bacillus spp.
2. Realice dos frotis; tiña uno con Gram y el otro con Scheaffer y Fulton
3. Observe la formación de esporas
4. Resiembra la colonia en agar sangre e incúbalo en aerobiosis.
35

36. 5. Incube a 37° por 24 horas
C
6. Siembre una prueba bioquímica para determinar la especie de la bacteria
(Diagrama 2).
Al término de la práctica serás competente para identificar los géneros de
bacterias que son capaces de formar esporas; tendrás la capacidad de identificar
esas esporas cuando adquieras la habilidad de observar esa estructura en el
microscopio diferente de una célula bacteriana. Tendrás la capacidad de identificar
los géneros y especies cuando hagas evaluaciones del metabolismo bacteriano
por el uso de pruebas bioquímicas. Aprenderás a integrar el diagnóstico clínico en
base a una remisión de muestra al laboratorio diagnóstico.
Material necesario
1. Agar sangre
2. Reactivos de Gram
3. Reativos de Scheaffer y Fulton
4. Cultivo de Bacillus spp.
5. Asa microbiológica
6. Porta objetos
7. Microscopio
8. aceite de inmersión
9. mecheros de bunsen
El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área
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37. Practica No 10
Prueba de sensibilidad a agentes antimicrobianos
Introducción: Se piensa que los quimioterapeúticos actúan de forma similar en
las infecciones; sin embargo, existe diversidad tanto en los grupos de antibióticos
y sus mecanismos de acción, como los microorganismos causantes de infección y
su susceptibilidad a aquellos, así como también debe considerarse al individuo
afectado y su estado inmunitario, el sitio de infección, la cronicidad y la
sensibilidad a la droga. El uso indiscriminado de los antimicrobianos a originado la
selección de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que es difícil predecir la
susceptibilidad con base en la sola experiencia clínica. La susceptibilidad de
microorganismos in vitro a los antimicrobianos puede medirse en el laboratorio.
Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el método de difusión en agar son
pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnados con
concentraciones conocidas de los diferentes quimioterapeúticos. Estos discos se
colocan sobre la superficie de cajas de agar previamente inoculados con la cepa
problema. Después de la incubación se observan halos de inhibición del desarrollo
bacteriano alrededor de los discos con quimioterapeúticos a los cuales el
microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la bacteria es resistente hay
crecimiento alrededor del disco. En Medicina Veterinaria no existen métodos
similares estandarizados para cada una de las especies animales por lo que la
aplicación de los estándares establecidos por Bauer et al., debe interpretarse con
cautela.
Propósito específico de la práctica: Conocerás la susceptibilidad de las
bacterias a quimioterapéuticos según el método de Bauer y cols. Comprenderás
por que es necesario auxiliarse con métodos de laboratorio para dar un
tratamiento con antibióticos para evitar la inducción de cepas drogoresistentes,
además de tener un tratamiento más certero en infecciones inducidas por
bacterias.
Desarrollo de la práctica:
1. Usarás el método de Bauer y et al. Desarróllalo siguiendo los siguientes pasos
2. Estandarice el inoculo agregando unas gotas del cultivo de 1 ml de E. coli al
tubo de SSF, hasta alcanzar una turbidez igual a la del tubo de 0.5 de Mc Farland.
3. Compara la turbidez de ambos tubos auxiliándose con la tarjeta que te fue
proporcionada para este fin. Esta turbidez corresponde aproximadamente a 5x107
a 5x109 unidad formadoras de colonias (UFC) por ml en el caso de E. coli, o en su
caso que se tenga una absorbancia de 0.1.
37

38. 4. Inocula la caja de agar MH con la suspensión estandarizada de E. coli antes de
15 min. para evitar cambios en las cuentas bacterianas.
5. Para la siembra introduce el hisopo en el inoculo, exprima el exceso de líquido
en las paredes del tubo y siémbralo con estría cerrada sobre toda la superficie del
agar.
6. Seca la superficie del agar dejando la caja semitapada junto al mechero durante
3 o 5 min.
7. Flamea las pinzas con el alcohol y con ellas coloque los sensidiscos sobre la
superficie del agar, asegurándose que queden perfectamente adheridos. Los
sensidiscos no deben quedar a menos de 15 mm. De la orilla del agar y deben
estar suficientemente separados entre si para evitar que las zonas de inhibición se
mezclen, interpretando mal su lectura.
8. Incuba las cajas a 37° por 24 hrs.
c
9. Determina el patrón de sensibilidad y resistencia de la cepa de E. coli midiendo
los halos de inhibición alrededor de los sensidiscos y comparando los mm con los
que aparecen en las tablas de referencia proporcionados.
10. Los antimicrobianos a pobrar son: ampicilina (10 microg), cloranfenicol (30
microg), gentamicina (10 microg), penicilina (10 U), tetraciclina (30 microg),
kanamicina (30 microg).
Al finalizar la sesión serás competente para seleccionar el tratamiento adecuado
por el uso de antibióticos cuando hayas evaluado diferentes drogas contra el
agente etiológico causante de la enfermedad. Tendrás la capacidad de prevenir la
drogo resistencia cuando selecciones adecuadamente la droga que usaras para el
tratamiento de los animales enfermos.
Material necesario
1. Un cultivo de E. Coli en caldo nutritivo 2ml.
2. Estándar de turbidez 0.5 de Mc Farland.
3. Tarjeta para comparación de turbidez
4. Discos de papel filtro impregnados con quimioterapéuticos (“sensidiscos”)
5. Pinzas
6. Tablas de referencia para leer resultados de susceptibilidad a
quimioterapéuticos.
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39. 7. Agar Müeller Hinton (MH)
8. Cuatro hisopos estériles.
9. Un tubo con 2.5 ml de solución salina fisiológica (SSF)
10. caldo de infusión cerebro corazón
11. una caja de agar Muller Hinton (MH)
12. una pipeta Pasteur.
El desarrollo de la práctica será impartido por personal capacitado en el área
39

40. Bibliografía:
Balows, A. et al., Manual of Clinical Microbiology. 1991. 5 th, ed ASM Washington
D.C.
Carter, G.R., Diagnostic procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology.
1978. 4 th, ed Charles C. Thomas Publishers. USA.
Scanlan Ch. M. Introducción a la bacteriología veterinaria. 1991. Ed Ediciones
Acribia, S.A. España.
Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. 1987. Microbiología Médica. Ed. Manual
Moderno. México DF.
Koneman EW, Allen SD, Dowell VR, Janda MW, Sommers HM, Winn JT. 1992.
Diagnóstico Microbiológico. Ed. Panamericana. Argentina.
Baron E, Fineguid S. 1990. Diagnostic Microbiology. Ed. Mosby Compan
Mc Faddin. jean. f. 1993. pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias
de importancia clínica. edit panamericana.
M en C GIL CRUZ MARTINEZ
40