Este documento presenta las buenas prácticas de laboratorio que deben seguirse para asegurar resultados precisos y evitar contaminaciones. Entre ellas se incluyen asegurar el buen funcionamiento de los equipos, almacenar y manejar muestras evitando su contaminación, emplear técnicas analíticas correctamente, y asegurar el uso de implementos de seguridad como mandiles y guantes. También describe los diferentes métodos para sembrar muestras en placas, como la siembra incorporada o en superficie, y los cuidados requer

1. BUENAS PRACTICAS
DE LABORATORIO

2. Generalidades de buenas
practicas de laboratorio
 Asegurar la ejecución de que los ensayos se realicen de
manera detallada y ordenada.
Seleccionar y utilizar el equipo y material señalado en la
técnica.
Colocar el material usado separado del material limpio, no
dejarlo sobre la mesa de trabajo.
Asegurar el buen funcionamiento de todos los equipos a
utilizar, su conexión, calibración y ubicación.
Almacenar y manejar todas las muestras evitando su
contaminación dentro del laboratorio.
.

3.  Preparar y almacenar los reactivos y medios de
cultivo según los procedimiento establecidos.
Emplear la técnica analítica correcta y de manera
exacta, cualquier cambio en el método debe estar
debidamente validado y aprobado.
Asegurar el uso de los implementos de seguridad,
tales como mandiles, gorras, extintores, etc.
Limpiar y desinfectar las mesas de trabajo antes
y después de los análisis de un alimento

4. MATERIAL DE VIDRIO
 Utilizar para los análisis, material de vidrio de baja
alcalinidad o material de plástico libres de defectos y
residuos tóxicos.
 Examinar antes de cada uso el material de vidrio y
desechar todos aquellos que presenten daños; si los
bordes están rotos pueden ocasionar cortaduras, si
las superficies internas están deterioradas o con
rajaduras pueden retener parte del precipitado que
desea analizar.
 Lavar y/o estabilizar el material de vidrio antes de
volver a usar

5. BOMBILLAS O AUXILIARES DE
PIPETAS
 Aspirar las muestras, diluciones de las
muestras, soluciones de reactivos o
suspensiones de microorganismos, utilizando
los auxiliares de pipetas.
 Cuando el auxiliar tenga contacto con las
sustancias antes mencionadas, cambiar el
filtro y colocar el auxiliar sin la bombilla de
succión en alcohol al 70% por una hora o
esterilizar sin la bombilla a 121 º C x 15
minutos si es necesario.

6. PERSONAL
 El personal del laboratorio está obligado a
usar bata y gorro de color blanco durante su
permanencia dentro del laboratorio y además
cuando se inicien los análisis y se efectúen
pasajes utilizará una mascarilla naso-bucal.
El personal externo para su ingreso al
laboratorio debe ponerse bata.

7. Tipos de siembre
 Se deposita 500 micrlotros de cada
dilución en placas estériles, vacías, por
duplicado. Se puede emplear la misma
pipeta para todas las diluciones si se
comienza por la más diluida.
Posteriormente, se agrega a cada placa
15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear,
previamente fundido y termostatizado a
45ºC (en baño o estufa). Se agita
moviendo la placa tapada sobre la
superficie de la mesa con movimiento
circular, horario y antihorario y y hacia
delante y hacia atrás.
 En algunas situaciones puede sembrarse
un volumen diferente, en general no más
de 3 mL por placa.
 Se deposita en la superficie de
las placas que ya contienen el
medio de cultivo, 0.1 mL de cada
dilución. Se realiza duplicado
para cada dilución.
 Se puede emplear la misma
pipeta para todas las diluciones
si se comienza por la más
diluida. Luego de realizada la
descarga de la muestra, se
procede a extenderla sobre toda
la superficie de las placas para
que se absorba, usando rastrillo
estéril.
SIEMBRA INCORPORADA SIEMBRA EN SUPERFICIE

8. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE
AMBOS MÉTODOS:
Incorporado Superficie
Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra
Mayor precisión Menor precisión
Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes
Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias
Visualización de colonias dificultosa Fácil visualización
Temperatura del agar puede afectar la viabilidad de
algunos m.o.
No se afectan los m.o. termosensibles
Se desarrollan m.o. microaerofilicos
En aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios
facultativos

9. Spreaders
 Es frecuente que desarrollen colonias extendidas
sobre la superficie o el fondo y bordes de la placa,
o que se den cadenas de colonias unidas. Este
tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se
cuentan como una. Cuando el spreader cubre
más del 50% de la placa, esta no debe contarse.
Cuando el spreader cubre una superficie menor
del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la
placa, SOLO si están uniformemente distribuidas.
 Si en todas las placas hay spreaders se informa :
Spreaders

11. Conservación de los medios
preparados
 Lo más recomendable es preparar el medio
cuando se va a emplear, aunque en muchos
casos por razones obvias una parte del medio
preparado se consume y el resto se guarda como
medio preparado. El tiempo de vida del medio
preparado dependerá de la propia naturaleza del
medio, de la hermeticidad de los recipientes que
lo contienen, de la temperatura de conservación y
de las condiciones medioambientales. Si la
hermeticidad es buena y la temperatura baja, 2-
8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6
semanas.

12. Conservación de los medios preparados,
listos para su uso
 Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo
limitado de conservación, que es de varios meses si las
condiciones de almacenamiento y transporte son las
adecuadas. Se recomienda su almacenamiento por regla
general por debajo de los 20ºC y protegidos de la luz.
Algunos medios deben conservarse entre 2-8ºC, siendo este
requisito especificado en la etiqueta del producto. Los
medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo
de 0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida
de agua puede provocar precipitados o hacer que cristalicen
ciertas sustancias del medio de cultivo, así como originar
grietas en las placas preparadas. En los medios de cultivo
que deben refundirse y que deben contener aditivos lábiles,
se suministra el medio basal preparado y según la necesidad
se deben añadir los aditivos de forma estéril.

13. Refundido de medios sólidos
 Cuando se precisa refundir los medios sólidos, preparados y
estériles en frascos y tubos, para verterlos en placa, es
aconsejable hacerlo en baño maría, en microondas o en
autoclave a vapor fluente. En ningún caso debe aplicarse
calor directo. Una vez fundidos, deberán dejarse enfriar
hasta unos 50ºC para añadir los aditivos, si fuera necesario y
para distribuirlos o sembrarlos. Hay que tener en cuenta que
los medios refundidos tienen una cierta tendencia al
oscurecimiento y precipitación, que aumenta cuando se
mantienen fundidos durante periodos de tiempo prolongados
y a temperaturas entre 45-65ºC y que ello puede suponer
una pérdida de las características nutritivas o selectivas del
medio, por lo que es aconsejable, no fundirlos más de una
vez y no mantenerlos en el calor largos periodos de tiempo.

14. Introducción
 ¿Qué utilidad tiene conocer las condiciones
que un microorganismos requiere para crecer?
# Obtenerlo en el laboratorio Cultivo
# Combatirlo o
evitar su proliferación

15. Nutrientes
 Substancias necesarias para
asegurar supervivencia.
 Proveen energía y elementos
necesarios para síntesis de
estructuras celulares.
 Ingreso por absorción.
 Viabilidad: capacidad de
reproducción.

16. Nutrientes esenciales o Básicos
 Asimilables por simple difusión o por
transporte activo
 Agua
 Fuentes de Carbono
 Compuestos de nitrógeno
 Fósforo (fosfatos inorgánicos)

17. Otros nutrientes
 Iones potasio
 Iones Magnesio
 Factores de Crecimiento u orgánicos
 Vitaminas
 Aminoácidos
 Oligoelementos
 Hierro
 Cobre
 Cobalto

18. Factores Estimulantes
 Influyen en el proceso de crecimiento.
 No son imprescindibles.
 En presencia de factores estimulantes crecen
mas rápido y mejor.

19. Categorías Nutritivas
 Fuente de Carbono
 Carbono inorgánico: dióxido de carbono
autótrofas o litótrofas
 Carbono orgánico: Heterótrofas u organótrofas
 Fuente de Energía
 Fotótrofas
 Quimiótrofas: energía suministrada por ATP

20. Crecimiento Bacteriano
 Aumento de número
(no de tamaño)
 Multiplicación
bacteriana: fisión
simple o binaria
 Elongación
 Auto duplicación de ADN
cromosómico
 Tabicado central
 Invaginación membrana
celular
 Síntesis de pared

21. Tiempo de generación
 Tiempo necesario para la duplicación celular
 Distintiva de cada especie
 Puede influirse por factores estimulantes
 Varían de 20 minutos (Escherichia coli) hasta
24 horas

22. Curva de Crecimiento
Bacteriano
•Bacteria en medio
adecuado
•Gráfico de coordenadas:
número de bacterias
(logaritmo) versus lapso de
tiempo.
•Distinta para cada bacteria
•En todas se identifican
cuatro etapas

23. Fase de Latencia
 El número de microorganismos no varía
 Adaptación al medio, producción de enzimas
 Tiempo variable: entre una hora a días.
 Tamaño relativo aumentado por división

24. Fase exponencial o de crecimiento
logarítmico
 Relación casi lineal entre el
tiempo y el número de
elementos.
 Actividad metabólica
incrementada
 Depende del tiempo de
generación de cada bacteria
 Los antimicrobianos son mas
activos
 Puede haber variaciones entre el
crecimiento in vitro e in vivo.

25. Fase Estacionaria
 En determinado punto el crecimiento disminuye
 La población no aumenta
 Células nuevas reemplazan a las células muertas
 Actividad metabólica mas lenta
 Células en animación suspendida
 Producción de metabolitos secundarios
 Antibioticos
 Toxinas
 Fase de Esporogenesis para las especies
productoras de esporas

26. Fase de declinación o muerte
 Recuento de células disminuye sensiblemente
 El numero de células muertas supera al
número de células vivas
 Acumulación de productos tóxicos
 Disminución de nutrientes
 Aparición rápida : autolimitar diseminación
infecciones

27. Técnicas para determinar el
número y viabilidad de las células
 Contar al microscopio el
número de células en un
volumen conocido
 Establecer el número de
células por turbidimetria
 Recuento de elementos
viables por cultivo (Unidad
Formadora de Colonias o
UFC)

28. Efecto de la Temperatura
 Temperatura mínima de crecimiento
 Temperatura óptima de crecimiento
 Temperatura máxima de crecimiento

29. Sicrófilos
 Requieren bajas temperaturas
 15 – 20 ºC
 La mínima puede ser muy baja
 Bacterias en el fondo del mar y en los polos

30. Mesófilos
 Rango de temperaturas: 25 – 40 ºC
 Temperatura óptima: 37 ºC ± 1 ºC
 Agentes que afectan al hombre y los animales

31. Termófilos
 Toleran altas temperaturas
 Temperatura óptima: 55 ºC
 Temperatura máxima: 80 ºC o mas.

32. Condiciones de pH
 pH : Potencial Hidrógeno. Va desde 0 a 14.
 pH < 6,5 ácido
 pH > 7,5 básico o alcalino
 pH 6,5 – 7,5 neutro Mas adecuado para
crecimiento bacteriano
 Bacterias que crecen hasta pH 4 Acidófilas
(Por ejemplo: Lactobacillus)
 Vibrio cholerae : medio alcalino

33. Presión Osmótica
 Los solutos (sales y azúcares) disueltos se
desplazan a zonas de menor concentración.
El agua se desplaza a zonas de mayor
concentración de solutos
 Una presión osmótica alta causa pérdida de
agua y plasmólisis de la célula
 Halófilas: bacterias que toleran altas
concentraciones salinas
 Halófilas facultativas : toleran hasta un 2 % de
sales

34. Condiciones atmósféricas
 Potencial de óxido-reducción o Redox (Eh)
 Respiración bacteriana : reacciones de óxido-
reducción, en cadena
 El aceptor final de electrones o hidrogeniones
es variable

35. Aerobios
 Requieren oxígeno, aceptor final de hidrógeno
 Formación de H2O y CO2
 Producción de enzima Catalasa :
desdoblamiento del Peróxido de hidrógeno
(H2O2) en H2O y oxígeno
 Prueba de Catalasa para diferenciar
microroganismos (Staphylococcus de
Streptococcus)