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Práctica 3 Reacción en cadena de la polimerasa
- 1. Terapia Investigación Diagnóstico Detección Decisiones Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR Blgo. Luis Carlos Lizárraga Vargas
- 2. PCR • La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis, • Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original.
- 3. PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA •Amplificación enzimática de un fragmento de DNA •(simulando una replicación natural del DNA “in vitro”) Replicación de ADN SIMILAR
- 4. Síntesis de ácidos nucleicos: generalidades • La hebra nueva de DNA se sintetiza en dirección 5’ 3’ • Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión) • La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA- dependiente.
- 5. • Componentes – desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) dATP, dTTP, dGTP, dCTP – Enzima Taq Polimerasa (Thermus aquaticus) – Iniciadores (Primers) Complementarios a la cadena de ADN – ADN molde Concentración de 20ng
- 8. ADN polimerasa Actuaaltas temperaturas Thermus aquaticus Estable a altas temperaturas Enzima de 95kd. Actividad Exonucleasa: 5’—3’
- 9. 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ PRIMERS (Iniciadores, Cebadores) Únicos: Asegura alta especificidad: La secuencia del extremo 3’ es critica para el funcionamiento Dos oligonucleótidos que son complementarios a cada una de las dos hebras del ADN. 5’ 3’ 3’ 5’
- 10. Tamaño • Efectos en: – tamaño 15 – 30 pb – No debe formar dimeros – Temperatura de aliniamiento entre 52C° -65C°
- 12. Desnaturación 94 oC 94 oC Anillaje 50-60oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 1. Desnaturalización: Apertura de la doble cadena 2. Alineamiento: Anillaje de primers 3. Extensión: Generación de la nueva cadena Etapas de la PCR 25-30 ciclos Desnaturación
- 14. PCR 94 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 3’ 5’ 5’ 3’ Calor DNA de cadena simple Desnaturación
- 15. PCR 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ Desnaturación 94 oC Hibridación de primers Desnaturación
- 16. PCR 94 oC Desnaturación 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 30 ciclos 3’ 5’ 5’ 3’ Calor Calor 5’ 5’ 5’
- 17. PCR 94 oC Desnaturación 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’
- 18. PCR 94 oC 94 oC Annealing Primers 50 oC Extensión 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ Calor Calor Desnaturación
- 19. PCR 94 oC 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ Desnaturación
- 20. Fragmentos de tamaño definido PCR 94 oC 94 oC Annealing Primers 50 oC Extension 72 oC Temperatura 100 0 50 Tiempo 30ciclos 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ Desnaturación
- 21. El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR. 0 # ciclos Numero de copias 1 3 8 2 4 1 2 4 16 5 32 6 64
- 25. Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man • La sonda se hibrida con el amplicón blanco. • Se encuentra bloqueada en el extremo 3´(fosforilada, no puede ser amplificado por la polimerasa). • Tiene dos colorantes fluorescentes unidos (R= reportero y Q= quencher). • El Q reduce la intensidad de fluorescencia del reportero cuando la sonda está intacta.
- 26. • Método consiste de 2 primers y dos sonas específicas de secuencia. Desnaturalización Pegado de primers y sondas Extensión por la ADN Polimerasa Extensión por la ADN Polimerasa y clivaje del Reportero Fluorescencia Sondas de Hidrólisis: Sondas Taq Man
- 27. Molecular Beacons • Es una sonda en horquilla. • Tiene una región específica de secuencia flanqueada por dos repeticiones invertidas. •.
- 28. • Cuanto mayor cantidad de ADN inicial, habrá un aumento más rápido de la señal fluorescente, resultando en un Ct más bajo. PCR en Tiempo Real