Este documento describe un experimento para comparar el metabolismo de una levadura bajo condiciones aeróbicas y anaeróbicas. El objetivo es determinar la cantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y la formación de metabolitos en cada condición. La metodología incluye incubar la levadura en medio de cultivo con y sin oxígeno, y medir el número de células y la concentración de glucosa en intervalos regulares para establecer las diferencias en el crecimiento.

1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUADALAJARA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
BIOTECNOLOGÍA
PRACTICA 1. COMPARACION DE LA RESPIRACIÓN Y LA
FERMENTACIÓN
OBJETIVO. El alumno analizará y distinguirá el comportamiento de una levadura
cuando su metabolismo se desarrolla bajo condiciones aerobias y bajo condiciones
anaerobias, relacionando los resultados de la producción de biomasa con la eficiencia en
cada proceso.
INTRODUCCION.
Las levaduras son microorganismos eucariotes ubicuos encontrados en diversos
ambientes naturales. Esta capacidad de colonización está relacionada con su alta
adaptabilidad fisiológica. Las rutas metabólicas entre diferentes especies de levaduras son
básicamente idénticas, sugiriendo la conformación de un grupo metabólicamente
homogéneo. Sin embargo, los mecanismos para la toma de nutrientes, el número de
diferentes isoenzimas, y sobretodo la regulación de fermentación y respiración difieren
sustancialmente.
En las levaduras, como otros organismos heterotróficos, el metabolismo de la
energía y el carbono están íntimamente interconectados, es decir, el anabolismo está
acoplado al catabolismo. El ATP provee la energía para toda clase de trabajo celular y es
provisto por la oxidación de moléculas orgánicas que también sirven como fuente de
carbono para la biosíntesis. En la naturaleza, las diferentes especies de levaduras utilizan
un espectro de fuentes de carbono, tales como polioles, alcoholes, ácidos orgánicos,
aminoácidos, pero prefieren los carbohidratos.
Enfocando la atención sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae, es un
microorganismo facultativo que emplea la respiración aerobia al igual que la
fermentación alcohólica para metabolizar la glucosa como fuente de energía y de
carbono. La glucosa inicialmente es transformada a través de la glicólisis hasta la
formación de piruvato, el cual es un punto de ramificación del flujo metabólico,
dependiendo de la presencia o no de oxígeno.
En la presente práctica, se tiene como objetivo que el alumno determina la
cantidad de biomasa producida, la velocidad de consumo de glucosa y formación
evidente de metabolitos bajo condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, para establecer la
diferencia del crecimiento de la levadura.
MATERIAL.
Medio de extracto de malta
Glucosa
Agua destilada
Levadura seca
Solución de azul de metileno 0.01%
Solución de DNS

2. Microscopio de campo claro
Microscopio de contraste de fases
Hematocitómetro
Pipeta Pasteur
Tubos de vidrio
Etanol
Baño maría
Termómetro
METODOLOGIA.
Medio de cultivo.
1.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 500 mL con 50 mL de medio extracto de malta
2.- Prepare 1 matraz erlenmeyer de 125 mL con 50 mL de medio extracto de malta
3.- Preparación del medio extracto de malta: pese 35 g de extracto de malta, 20 g de
glucosa, disolver el extracto de malta y la glucosa en 1 L de agua destilada.
4.- Esterilizar en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada
4.- Colocar el medio en los matraces y esterilizar por calor.
Suspensión de levadura.
1.- Pesar 0.5 g de levadura seca y adicionar a 10 mL de agua destilada en un tubo de
ensaye, mezclar hasta obtener una suspensión uniforme.
2.- Realizar conteo en cámara de Neubauer
3.- Anotar la cuenta de levaduras y calcular el número de células por mL.
Incubación.
1.- Tome uno de los matraces y transfiera 1 mL de suspensión de levaduras, etiquete
como fermentación y coloque en una incubadora a 30ºC.
2.- Tome el segundo matraz y transfiera 1 mL de suspensión de levaduras, etiquete como
respiración y coloque en una agitadora a 30ºC y 200 rpm.
3.- Realice observaciones en 1 hora, 12 horas y 24 horas. Tome muestre en cada matraz y
guárdelos en refrigeración.
4.- Determine el número de levaduras para cada muestra.
5.- Determine la cantidad de glucosa en cada muestra.
Conteo de levaduras.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solución homogénea, colocar una alícuota en el hematocitómetro y
realice el conteo al microscopio. En el apéndice 1 encontrará información acerca del uso
del hematocitómetro o de la cámara de Neubauer.
1. Verifique que el microscopio está alineado, y en su caso haga la corrección necesaria.
2. El conteo se realiza en 5 cuadros grandes, considerando que estos formen una cruz.
3. Realice el cálculo del número de células/mL.

3. Determinación de glucosa.
La determinación de glucosa se realiza utilizando el método del DNS (apéndice 2).
1) Diluir la muestra, calculando que la concentración de glucosa se encuentre en el rango
de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilución.
2) Tomar un alícuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso
3) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar
4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
5) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.
7) Interpolar lectura en la curva patrón para determinar la concentración de glucosa.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es el papel del azul de metileno en la tinción de levaduras?
2.- ¿Qué es fermentación desde el punto de vista bioquímico?
3.- ¿Cuántas y cuáles son formas de reproducción tiene Saccharomyces cerevisiae?
4.- Explique cómo se coloca la muestra para el conteo en la cámara de Neubauer
5.- ¿Qué es respiración celular?
6.- ¿Dónde se obtiene mayor biomasa, en la respiración o en la fermentación? Explique
por qué
7.- La técnica del DNS es útil para cuantificar sacarosa, por qué
8.- ¿Qué es la glucólisis?
9.- ¿Qué es el catabolismo?
10.- Durante los experimentos que desarrolló, Saccharomyces cerevisiae realizó
anabolismo, explique.
REPORTE.
Realice un reporte por equipo que contenga: Titulo de la práctica, objetivo, introducción
breve, metodología, resultados, discusión, conclusión, bibliografía. Como guía puede
utilizar el formato de cualquier artículo científico.

4. APENDICE 1. CUANTIFICACION DE LEVADURAS
OBJETIVO. El alumno cuantificará levaduras mediante la técnica de conteo directo al
microscopio.
CONTEO EN CÁMARA DE NEUBAUER.
La cámara de Neubauer es una cámara de conteo que se utiliza para determinar el
número de células.
Figura 1. Cámara de Neubauer.
Para utilizar la cámara de Neubauer realice el siguiente procedimiento:
• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.
• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar
centrada.
• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución
de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya
que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de
llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es
de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.
Para el conteo: Lleve la cámara al microscopio y enfoque el cuadro de conteo con
el ocular de 4X. Al hacerlo observará en el campo una imagen parecida a la figura 2.
Figura 2. Cámara de Neubauer en 4X
• Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc.,
ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente
manera:

5. Figura 3. Cámara de Neubauer en 10X
• En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células
presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central,
lo que garantiza un conteo aleatorio.
• Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los
campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en
todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (alto
poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:
Figura 4. Cámara de Neubauer en 40X
• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el
conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no
se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el
cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células
son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la
segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen.
Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X
son las que no se deben contar.
Figura 5. Conteo en cámara de Neubauer.

6. • Después de contar las células se procede a calcular el número de células por unidad de
volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en
el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara
y la laminilla de cuarzo. La cámara de Neubauer tiene las siguientes dimensiones, y su
profundidad es de 0.1 mm.
Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las células u
otras partículas no se sobrepongan, y deben estar uniformemente distribuidas. Para
células pequeñas se recomienda contar cuatro esquinas 1/25 mm2 y el cuadro del centro.
Por ejemplo, si se cuentan 187 células en los cinco cuadros descritos. Cada cuadro tiene
un área de 1/25 mm2, y 0.1 mm de profundidad. El volumen total en cada cuadro es de
(0.04x0.1 = 0.004) 0.004 mm3. Si se contaron 5 cuadros, entonces se tiene un volumen de
0.02 mm3. Por lo tanto, se tienen 187 células en 0.02 mm3, que equivale a 9350
células/mm3. Hay 1000 mm3 en 1 cm3, por lo que la cuenta es de 9 350 000 céluals/mL.
Para fines prácticos, si se cuentan 5 cuadros como los indicados anteriormente:
Células/mL = Total de células contadas * 50000
Para determinar el número de células en la muestra original hay que multiplicar
por la dilución.
METODOLOGIA.
A la muestra de 1 mL con levaduras adicionar 0.1 mL de azul de metileno y
homogenizar. De la solución homogénea, colocar una alícuota en la cámara de Neubauer
y realice el conteo al microscopio.

7. APENDICE 2. DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES POR DNS
OBJETIVO: Determinar el contenido de azúcares reductores en mosto fermentado
mediante el uso del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) mediante espectroscopia visible.
INTRODUCCION
El método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) se basa en la reducción del DNS
(de color amarillo) al reaccionar con un azúcar reductor para formar ácido 3-amino-5-
nitrosalicílico (de color rojo ladrillo), cuya presencia puede detectarse por lectura de la
absorbancia en la zona de 540-570 nm.
MATERIALES.
DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
Fenol
Sulfito de sódio
Hidróxido de sodio
Agua destilada
2 Vasos de precipitado de 600 mL
1 Matraz aforado de 100 mL
1 Matraz aforado de 1 L
Tubos de ensaye
Espectrofotómetro
Pipetas volumétricas de 1 mL
Pipeta volumétrica de 2 mL
Pipeta volumétrica de 5 mL
PROCEDIMIENTO.
Preparación de la solución de DNS.
1) Pesar 1 g de hidróxido de sodio y disolverlo en 70 mL de agua destilada en un matraz
Erlenmeyer con agitación. CUIDADO EL HIDRÓXIDO DE SODIO IRRITA LA PIEL.
2) Pesar 1 g de DNS y adicionar por porciones a la solución de hidróxido de sodio con
agitación, para lograr una disolución rápida y completa.
3) Esperar a que la solución se enfrié a temperatura ambiente
4) Pesar 0.2 g de fenol y adicionar a la solución anterior con agitación.
5) Pesar 0.05 g de sulfito de sodio y adicionar a la solución anterior con agitación.
6) Una vez que todo este bien disuelto y mezclado, transferir cuantitativamente a un
matraz aforado de 100 mL y aforar con agua destilada. Homogeneizar la solución.

8. 7) Guardar la solución en un frasco ámbar para proteger de la luz.
Preparación de curva patrón.
1) Preparar una solución estándar de 1 mg/mL de glucosa
2) Preparar una serie de tubos con las cantidades indicadas en el cuadro siguiente:
Tubo Concentración Glucosa mL de mL de
Número (mg/mL) Solución agua
Estándar destilada
1 0 0 1
2 0.1 0.1 0.9
3 0.2 0.2 0.8
4 0.3 0.3 0.7
5 0.4 0.4 0.6
6 0.5 0.5 0.5
7 0.6 0.6 0.4
8 0.7 0.7 0.3
9 0.8 0.8 0.2
10 0.9 0.9 0.1
11 1.0 1.0 0
3) Tomar una alícuota de 0.5 mL de la solución de glucosa para cada dilución
4) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar
5) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
6) Aforar a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
7) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.
Preparación de muestras.
1) Diluir la muestra si el contenido de azúcares reductores es mayor a 1 mg/mL, para que
se encuentre en el rango de 0 a 1 mg/mL de glucosa. Anotar dilución.
2) Tomar un alícuota de 0.5 mL de muestra diluida, si es el caso
3) Agregar 1.5 mL de solución de DNS y agitar
4) Calentar en agua hirviendo por 5 minutos
5) Aforar a 10 ml adicionando 8 mL de agua destilada y homogeneizar
6) Dejar enfriar y leer absorbancia en el espectofotómetro a 550 nm, calibrando con el
blanco.
Cálculos
1) Con las lecturas de la curva patrón hacer una regresión lineal de concentración de
glucosa contra absorbancia y calcular la ecuación de regresión lineal correspondiente.
2) Sustituir el valor de absorbancia de la muestra en la ecuación de regresión y calcular la
concentración de azúcares reductores expresados como glucosa. Al dato obtenido
multiplicarlo por la dilución.