Este documento describe técnicas para determinar la viabilidad y realizar el conteo de células, incluyendo el uso de tintes como Trypan Blue y métodos como el hemocitómetro. Explica cómo calcular la concentración celular requerida para cultivos y siembra en laminillas usando factores de dilución y volúmenes de muestra.

1. Viabilidad y Conteo celular
Técnicas de Cultivo
Celular

2. Viabilidad
 Mide la proporción de células vivas luego de
procedimiento
 Pruebas para determinar rompimiento de la
integridad de la membrana
 Mide la entrada de tinte que normalmente es
impermeable
 Trypan Blue, Erythrosin

3. Tintes viabilidad
 Células vivas son impermeables a Trypan
Blue y Naphthalene Black
 Células muertas permiten la entrada del tinte
y microscopicamente se observan teñidas

4. Ensayos de viabilidad
 Exclusión de tinte sobreestima viabilidad
 Usos:
 congelación,
 tripsinización,
 subcultivos

5. Conteo de células viables
 Hemocitómetro
 Trypan Blue
 Proporción - suspensión: tinte 1:1
 50 uL suspensión de células:50 uL tinte
 20 uL en cada lado de la cámara
 Microscopio de luz objetivo 10X
 Cuente en 5 cuadrantes vivas y muertas

6. Cuadrantes para conteo
1 2
5
3 4

7. Calcule el porciento de células viables
en cada cámara
1. El porciento de células viables es igual al
número de células no teñidas divididas por
el total de células contadas multiplicadas
por 100. Saque el promedio de ambas
cámaras. Solo debe utilizar células si el %
de viabilidad es mayor de 90%.

8. Conteo celular

9. Conteo Celular
 Cuantificación celular es necesario para:
*caracterización de líneas celulares
*establecer condiciones reproducibles de
cultivo
*consistencia de cultivos primarios
 Conteo
*hemocitómetro
*conteo electrónico

10. Hemocitómetro
Áreas de conteo
Este sistema tiene 2 áreas de conteo
separadas, cada una debe contener de 0.1
mm3 de muestra cuando se cubre con un
cubre objetos especial

11. Cubre objetos especial
 Un cubreobjetos
especial, grueso se
monta sobre dos barras
Bar
de cristal y esto forma
las dos cámaras.
Bar

12. Cuadrículas de conteo
Líneas finas en le piso de
la cámara ayudan con el
conteo celular.
El # células por ml =
Promedio del # de
células de los cuadros de
las esquinas x 104.
1, 3, 7, 9

13. La transferencia de la suspensión
celular se hace por capilaridad
Llene la cámara con la
suspensión celular utilizando
una pipeta con punta fina
aplicándola sobre el área
escavada de la cámara
Deje la suspensión entrar por
capilaridad
No ejercer presión durante el
llenado con presión

14. Conteo celular
 El # células por ml =
Promedio del # de células de los cuadros de las
esquinas x 104.
 Si el conteo es muy alto se debe diluir la
suspensión para evitar errores de muestreo

15. Dilución de células para el contaje
 Añada 40 ul de la suspensión de células en
un tubo Eppendorf. Diluya con 360 ul de
medio. Esto corresponde a una dilución
1/10.
 1 mL = 1000 ul 100uL es 1/10 de 1000.
Factor de dilución 101

16. Uso del hemocitómetro
Cuente las células en los cuatro cuadrantes
de las esquinas.
 Cada cuadrante es 1 x 1mm (1mm2) .La
profundidad de la cámara es 0.1mm. Si
contamos en un área de 1mm con
profundidad de 0.1mm el volumen es de 0.1
mm3 ó 104

17. 1 2
3 4

18. Cálculos para determinar la
concentración de células
 El conteo total lo divide entre el número de áreas
contadas (número de células/ 4)
Número de células X factor de dilución X
volumen = células/mL
Número de células X factor de dilución X 1000 =
células/ mL
Número de células X 101 X 104 = células /mL

19. Determinación de concentración
celular
 Concentración deseada para el cultivo
1.5 X10 6 células /mL
 volumen final 5 mL /frasco de cultivo
 1.5mL X106 X 5 mL=cantidad de
células/frasco
 1mL_____ células X 5 mL X número de
frascos = total de mL de células

20. Cálculo de concentración celular
para cultivar
 1mL/______células = ________/1.5 X 106

21. Concentración para cultivar en
laminillas
 http://www.youtube.com/watch?feature=play
er_detailpage&v=TmPOmi2NHb0

22. Determinación concentración celular
 1.5 X 104 X 10=1.5 X 105 Cantidad de
células /laminilla
 1mL/____________células =
______________/1.5 X 105
 Una vez calcule el volumen de células que
se requiere se completa hasta un volumen
final de 4 mL.

23. Determinación de concentración
celular
 Cada laminilla tiene 8 pozos y se necesitan
1.5 x 104 células por pozo. Se añaden 2
pozos para no preparar con exactitud. Tener
un poco adicional a lo que se necesita (2
pozos extras). Para 10 pozos necesito un
volumen de 400uL X 10 pozos = 4000uL= 4
mL totales. Al volumen total (4 mL) se le
resta el volumen de células que se calcule
luego del contaje