Este protocolo describe los métodos para identificar muestras de ADN mediante el análisis de dos loci polimórficos: la secuencia Alu y el locus VNTR D1S80. Se extrae ADN de muestras bucales y se amplifica cada locus mediante PCR. Los productos de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar los genotipos de cada individuo y compararlos.

1. Protocolo Prácticas de Biología Molecular
1. Introducción:
En esta práctica se pretende ilustrar la aplicación de los métodos utilizados en el análisis forense
para la identificación biológica y la obtención de la huella genética.
Para lograr esta identificación Podemos realizar el análisis por PCR de dos tipos de secuencias
de DNA repetitivo existentes en el genoma humano: una secuencia Alu y un locus VNTR.
Ambas son polimórficas, es decir, poseen más de un alelo por locus.
En el primer caso, el amplificado de Alu es dimórfico, pues muestra la presencia o ausencia de
la inserción de una secuencia Alu. La ventaja de este locus es que es relativamente fácil de
amplificar y al tener sólo dos alelos, simplifica los análisis estadísticos poblacionales.
La estructura corta y repetitiva de los VNTRs los hace más difíciles de amplificar y sus
numerosos alelos complican los análisis estadísticos. Por otra parte, el elevado polimorfismo de
estas secuencias asegura un alto número de diferentes genotipos en cada clase. Tales diferencias
entre ambos loci ilustran las ventajas y desventajas de su utilización en diferentes aplicaciones.
En principio usaremos uno de los dos LOCI.
1.1. Identificación de secuencias Alu (TPA-25)
En este experimento, se utiliza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar
una secuencia nucleotídica del cromosoma 8 y verificar la inserción (o no) dentro del gen del
activador del plasminógeno tisular (TPA) de una copia de una secuencia Alu.
Existen muchas regiones en el genoma humano que muestran variabilidad inter-individual.
Tales regiones se denominan polimórficas y ofrecen las bases para la diagnosis de enfermedades
de origen genético, la identificación forense y las pruebas de paternidad.
La familia Alu pertenece al grupo de secuencias de DNA repetitivo definido como elementos
cortos dispersos (SINEs) que se encuentran distribuidos por todo el genoma de primates y
humanos. En los pasados 65 millones de años, estas secuencias se han amplificado mediante
transposición vía un RNA intermediario, hasta 1.000.000 copias, lo que representa el 5 % del
total del DNA genómico.
Se cree que las secuencias Alu derivan del gen 7 SL RNA que codifica el componente de RNA
de la partícula de reconocimiento de señal que interviene en la síntesis protéica.
Los elementos Alu tiene un tamaño de unas 300 pb, y su nombre deriva de un lugar de
reconocimiento para el enzima de restricción Alu I que se encuentra en la mitad de la secuencia.
Se estima que entre 500 y 2000 secuencias Alu son exclusivas del genoma humano. Unas pocas
de éstas se han insertado recientemente, en el último millón de años, y no están fijadas en la
especie humana, de forma que puede encontrarse variación inter-individual. Uno de tales
elementos Alu, TPA-25, se encuentra dentro de un intrón del gen del activador del
plasminógeno tisular. Esta inserción es dimórfica, es decir, que está presente en unos individuos
y no en otros. Por esto, la PCR puede utilizarse para verificar si tal secuencia se encuentra o no
en un individuo particular.
En este experimento, utilizamos unos cebadores complementarios a las regiones que flanquean
el lugar de inserción de la secuencia TPA-25, para amplificar un fragmento de 400 pb., si se
encuentra la secuencia TPA-25, o de 100 pb. si no está tal secuencia. Cada uno de los tres
posibles genotipos (homocigotos para la presencia de TPA-25 que dan lugar a una banda de 400
pb.), heterocigotos (dos bandas de 400 y 100 pb.) u homocigotos para la ausencia de TPA-25
(una sola banda de 100 pb.), pueden ser identificados mediante una electroforesis en un gel de
agarosa.

2. 1.2.- Identificación de los alelos de un locus VNTR (D1S80):
Los análisis basados en el perfil de DNA se centran fundamentalmente en las regiones
hipervariables del genoma. A este grupo pertenecen las Repeticiones en Tandem de Número
Variable (VNTRs). Un locus de DNA perteneciente a estas regiones es el denominado D1S80
(Kasai et al., 1991). Se localiza en el cromosoma 1 y está compuesto por repeticiones de 16
nucleótidos. El número de repeticiones varía de un individuo a otro, y habitualmente oscilan en
el rango entre 15 y 41 (Budowle et al., 1995). Esta variabilidad en el número de repeticiones, es
decir, de alelos, hace a este locus muy útil para el análisis de los perfiles de DNA.
La fuente de DNA molde es una muestra de varios miles de células obtenidas de la mucosa
bucal de forma no agresiva. Las células se recogen mediante centrifugación y se resuspenden.
Las células se lisan y se centrifugan para eliminar los restos. Una muestra del sobrenadante
conteniendo el DNA genómico se mezcla con la Taq polimerasa, los cebadores, los 4
deoxinucleótidos, y el cofactor cloruro de magnesio. A continuación se realizan los ciclos de
desnaturalización, complementación y elongación de la hebra de DNA.
2. Objetivo:
A fin de comparar los genotipos de diferentes individuos, se cargan en un mismo gel el
resultado de amplificaciones con distintas muestras de DNA.
Después de la electroforesis se puede determinar si un individuo es homocigoto o heterocigoto
según aparezcan una o dos bandas en el gel, y el tamaño de éstas.
3. Materiales a usar:
Primers:
Los primers para la secuencia D1S80 son:
D1S80-5’: 5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3'
D1S80-3’: 5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTG-3'
Los primers para la secuencia Alu son:
Alu-5’: 5’-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3’
Alu-3’: 5’-CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT-3’
Reactivos:
• 0.9% sodio cloruro
• Isopropanol
• Etanol
• Agua destilada
• Tampón de carga
• Agarosa
• Tampón de extracción: (200 mM Tris-ClH pH 8, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5%
SDS)
• Tampón TBE
• 1 microgramo/ml GelRed (sustitutivo del Bromuro de Etidio)
• Kit de amplificación por PCR: Nucleótidos, Taq Polimerasa, Buffer.
Equipo y materiales
• Micropipetas y puntas: 10-200 μl, 0.5-10 μl
• Pipetas pasteur
• Tubos Eppendorf de 1.5 ml, 0.2 ml PCR
• Recipiente de deshechos, Baño de agua 65ºC.

3. • Termociclador (en nuestro caso tres baños de agua a distintas temperatura.
• Microcentrifuga
Practica 1: Extracción y purificación de DNA
1. Raspar el interior de la mejilla vigorosamente con un palillo
2. Colocar el palillo en un tubo eppendorf limpio y añadir 1 ml. de agua destilada. Agitar
vigorosamente durante unos segundos. Retirar el palillo y centrifugar en microfuga
durante 45 segundos.
3. No alterar el pellet. Si esto ocurre, centrifugar otra vez.
4. Eliminar todo el agua posible sin alterar el pellet.
5. Agitar en en tubo eppendorf en 200 µl de tampón de extracción. Añadir otros 400 µl de
tampón de extracción y agitar el tubo vigorosamente.
6. Incubar a 65 °C durante 10 min.
7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min.
8. Transferir todo sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf con cuidado de no alterar el
pellet.
9. Añadir un volumen igual de isopropanol frío por la pared del tubo (300 µl) y mezclar
con cuidado.
10. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min.
11. Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el
precipitado.
12. Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore
el isopropanol.
13. Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo.
14. Añadir unos 500 µl de etanol al 70% (hasta unos 2/3 del tubo), agitar vigorosamente
hasta que se resuspenda el pellet y centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos.
15. Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el
precipitado.
16. Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore
el etanol.
17. Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo.
18. Se pueden repetir los pasos los pasos del 14 al 17 para purificar el DNA.
19. Resuspender en 50 µl de agua destilada y estéril y guardar a -20ºC hasta su utilización.

4. Práctica 2: amplificación de fragmentos por PCR
Se rotulan dos tubos de PCR (0,2 µl) para identificar tanto quien hace la reacción como el locus
que se va a amplificar.
Instrucciones del kit de DNA polimerasa de Promega:
Component
Final
Volume
Final
Concentration
5X
Green
or
Colorless
GoTaq®
Flexi
Buffer1
10μl
1X
MgCl2
Solution,
25mM1
2–8μl
1.0–4.0mM
PCR
Nucleotide
Mix,
10mM
each
1μl
0.2mM
each
dNTP
upstream
primer
Xμl
0.1–1.0μM
downstream
primer
Yμl
0.1–1.0μM
GoTaq®
G2
Flexi
DNA
Polymerase
(5u/μl)
0.25μl
1.25u
template
DNA
Zμl
<0.5μg/50μl
Nuclease-­‐Free
Water
to
50μl
1Thaw
completely,
and
vortex
thoroughly
prior
to
use.
Lo que vamos a hacer:
MIX
por
X
reacciones
Component
POR
REACCIÓN
15
Reacciones
5X
Green
or
Colorless
GoTaq®
Flexi
Buffer1
10
150
microlitros
MgCl2
Solution,
25mM1
2
30
microlitros
PCR
Nucleotide
Mix,
10mM
each
1
15
microlitros
upstream
primer
(100
microMolar)
0,5
7,5
microlitros
downstream
primer
(100
microMolar)
0,5
7,5
microlitros
GoTaq®
G2
Flexi
DNA
Polymerase
(5u/μl)
0,25
3,75
microlitros
template
DNA
4
60
microlitros
Nuclease-­‐Free
Water
31,75
476,25
microlitros
TOTAL
50
750
microlitros
Condiciones de la PCR:
Condiciones de amplificación para D1S80:
94º 3 min.
94 º C 1 min., 65ºC 1 min., 72ºC 1 min., 25 ciclos
72º 10 min.
Condiciones de amplificación para Alu:
94ºC 4 min.
94ºC 1 min., 60ºC 2 min., 72ºC 2 min., 25 ciclos
72ºC 10 min.

5. Práctica 3: Electroforesis en gel de agarosa y análisis de resultados
Fabricar el Gel de agarosa al 2%:
Para 100 ml de gel:
• 2 gr de agarosa
• 1 µl de GelRed
• 100 ml de TBE
Calentar el TBE con la agarosa hasta que hierva, dar unas vueltas continuamente para evitar que
se queme. Verter sobre la cama, poner el peine y esperar a que se enfríe en la nevera.
Se saca el gel y se coloca en la cubeta de electroforesis.
Cargar 20 µl de cada muestra. Poner a correr el gel a 100V durante 60-90 minutos. El ADN
migra hacia el polo positivo (negro) porque está cargado negativamente.
Ver los resultados con la lámpara UV.