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- 1. RT-LAMP MR. Xiomara Silvia Coaguila Quispe Residente de Patología Clínica Hospital Nacional Hipólito Unanue
- 2. Introducción • Año 2000 (Notomi y colaboradores), publicaron un estudio sobre una nueva prueba molecular llamada LAMP (consiste en la amplificación de ácidos nucleicos en condiciones isotérmicas).
- 3. Coronavirus o Viriones con envoltura o Aspecto esférico o Diámetro 0.06um-0.14um (80-160nm) o Espículas que emergen de la superficie de los viriones o Genoma de RNA monocatenario o Polaridad positiva o Mayor grupo entre los virus de ARN o Genoma de 27 a 32 kilobases, o 5´ cap 7-metil-Guanosina, una cola de poli-A y más de 10 marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés) o Codifica 29 proteínas entre ellas proteínas estructurales y no estructurales.
- 4. SARS-CoV-2
- 6. PRUEBA MOLECULAR LAMP • AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR LAZO • Desarrollada en el 2000 por Notomi y col. • Método alternativo a la PCR, • Laboratorios de diagnóstico en los sitios de atención primaria • Sensible y específico, rápidos, precisos para emitir un diagnóstico. Loop-Mediated Isothermal Amplification
- 7. LAMP AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA POR LAZO • Método: se basa en la amplificación del ácido nucleico empleando una ADN polimerasa y un conjunto de cuatro cebadores que reconocen un total de seis secuencias distintas del ADN viral en condiciones isotérmicas. • Actualmente, es posible combinar la prueba LAMP y la transcripción inversa en una sola reacción (RT-LAMP). • Numerosos estudios han demostrado la aplicación exitosa de esta prueba para detectar ARN de coronavirus en muestras de pacientes, exhibiendo mayor sensibilidad y especificidad que las pruebas de RT-PCR, además de ser significativamente rápido y no requerir reactivos o instrumentos costosos.
- 8. • Las pruebas RT-LAMP fueron desarrolladas para identificar con mayor frecuencia el gen N (04 estudios), seguido de los genes ORF1a y N (02 estudios), gen RdRp (01 estudio), gen ORF1a (01 estudio) y genes ORF1ab y S (01 estudio).
- 9. • Paso de transcripción reversa (ARN ADN) RT -LAMP • LAMP (Amplificación) 60-65°C • Utiliza Rx: • Reactivo LAMP: ADN polimerasa Transcriptasa reversa Detección rojo fenol • Cebadores: F3 B3 FIP BIP Loop F Loop B
- 10. Enzima ADN polimerasa • Sensibilidad del método de amplificación LAMP: DNA polimerasa termostable proveniente del bacilo Bacillus stearothermophilus, denominada “Bst”. • (Bst) que se caracteriza por realizar amplificaciones con desplazamiento de cadena. • Actividad de helicasa para abrir la doble cadena de DNA, además de poseer una actividad de exonucleasa 5´-3´y carecer de actividad de corrección exonucleasa 3´-5´. • Funciona óptimamente entre 60-65°C.
- 11. • Rx. LAMP se necesitan # de 4 hasta 6 cebadores. • 2 cebadores externos F3 y B3, • 2 cebadores internos FIP (F1C, F2) y BIP (B1C, B2) • Secuencias: sentido y antisentido • Ayuda en la formación de un bucle, • 2 cebadores bucle F(FLP) y B(BLP) • Diseñados para la rx. de amplificación • mediante la unión adicional a sitios que • no son accesibles por los cebadores internos.
- 13. • Principio fundamental LAMP • Es la amplificación del templado original para producir una gran cantidad de productos de amplificación de DNA, que contienen una secuencia mutuamente complementaria y alternada, de una estructura repetida. (Tomita et al., 2008).
- 14. • AMPLIFICACIÓN • 2 pasos: no cíclico y cíclicos. • NO CÍCLICO • Los cebadores inician su acción en dirección 5'->3' Internos Externos amplificación
- 15. • Ciclico: • Asas o bucle • Cebadores internos • Transcurso de la polimerización las secuencias sintetizadas van adquiriendo una forma de coliflor. T° constante (60ºC - 65ºC)
- 16. Detección del producto amplificado • Turbidez • Electroforesis en gel agarosa • Fluorescencia • Cromatografia • Colorantes: Detecta cambio del pH ROJO FENOL
- 17. MINSA, a través del Instituto Nacional de Salud (INS), desarrolló una prueba molecular isotérmica “LAMP”, que ha sido implementada a partir de septiembre 2020 en laboratorios seleccionados de DIRIS, DIRESAS y hospitales para el diagnóstico del virus SARS-CoV-2. https://web.ins.gob.pe/index.php/es/prensa/noticia/diagnostico-molecular-traves-del-metodo-lamp-acercando-los-resultados-al-primer
- 20. Laboratorio de Biología Molecular -Cenex
- 24. • Alicuotado las muestras • Extracción de ARN viral Laboratorio: Analítica
- 26. • Área Limpia • Preparación del Master Mix • Cargado de ARN
- 27. AMPLIFICACIÓN
- 28. Laboratorio: POST ANALITICA • INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
- 30. • REPORTE DE RESULTADOS, VERIFICACIÓN Y ENTREGA DE RESULTADOS
Notas del editor
- La técnica de LAMP fue desarrollada en el 2000 por Notomi y colaboradores, y sensible, que pudiera ser utilizada fuera de los laboratorios de diagnóstico /Actualmente, la técnica molecular estándar para detectar SARS-CoV-2 es la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Sin embargo, el tiempo requerido para obtener resultados puede demorar hasta 2 o 3 días, considerando el transporte de las muestras a un laboratorio central con nivel de bioseguridad 2 o superior.
- LAMP Es una variante de las PCR isotermales Cuyo método se basa en la amplificacion....que ha generado mayor interés debido a su fácil manejo y bajo requerimiento técnico.
- E: gen de envoltura N: gen del nucleocápside RdRp: RNA dependiente de la RNA polimerasa RNase P: gen humano RNase P Traducido de Lipi et al., 2020
- 2 pares de cebadores cores 1 par extra
- Las polimerasas Bst fuerte actividad de desplazamiento de cadena, polimerización rápida y mayor tolerancia a la sal e inhibidores cuando se usan con el tampón de reacción especializado tolerante a inhibidores. La enzima BST sin glicerol de alta concentración 100x se diseñó específicamente para maximizar la flexibilidad del ensayo para el desarrollo de pruebas de diagnóstico LAMP. Sensibilidad del método de amplificación LAMP: DNA polimerasa termostable proveniente del bacilo Bacillus stearothermophilus, denominada “Bst”. (Bst) que se caracteriza por realizar amplificaciones con desplazamiento de cadena, es decir permite realizar las reacciones de amplificación en cadenas de doble hebra, produciendo al final una hebra simple y otra doble. La Bst DNA polimerasa tiene una actividad de helicasa para abrir la doble cadena de DNA, además de poseer una actividad de exonucleasa 5´-3´y carecer de actividad de corrección exonucleasa 3´-5´. Esta enzima Funciona óptimamente entre 60-65°C, aunque su estabilidad térmica está en un rango de 45-65°C y se desnaturaliza arriba de 70°C, por lo que es considerada como un buen candidato para uso biotecnológico, y aplicaciones en sistemas de detección como la amplificación isotérmica mediada por asa.
- que tienen secuencias tanto sentido y antisentido de tal manera que ayuda en la formación de un bucle, 2 cebadores bucle F(FLP) y B(BLP) diseñados para acelerar el reacción de amplificación mediante la unión adicional a sitios que no son accesibles por los cebadores internos. Se ha propuesto modificaciones a la técnica original de Notomi, que es la inclusión de un par de primers denominados Loop primer F y Loop primer B, que contienen secuencias complementarias entre las regiones F1 y F2 / B1 y B2 donde se forma el asa, implicando un número mayor de puntos de partida para la síntesis del DNA, lo que se ve reflejado en la disminución del tiempo de amplificación [5].
- NO CÍCLICO .- Los cebadores inician su acción en dirección 5'->3', el primer cebador en interactuar con el DNA blanco es el FIP el cual se une a su región complementaria F2c y así comienza a sintetizar la hebra complementaria del DNA blanco (figura 3A), el siguiente cebador en interactuar es el F3 uniéndose a la región F3c complementaria del DNA blanco, la Bst polimera-sa tiene una cualidad, esta actúa también como helicasa lo que ocasiona que la doble hebra se abra y la F3 pueda seguir con su camino; por el otro extremo tanto BIP como B3 siguen los mismo paso, la hebra complementaria simple cadena hace que por complementariedad sus extremos formen un loop o buble esta hebra es la que servirá como secuencia madre para la posterior síntesis de DNA.
- CICLIZACIÓN: En la secuencia madre, interactúan nuevamente el cebador FIP donde la región F2 se una a su región F2c de la hebra complementaria realizando la hibridación así como también por el otro extremo BIP donde la región B2 se une a su región B2c de la hebra complementaria, en el transcurso de la polimerización las secuencias sintetizadas van adquiriendo una forma de coliflor. Ambos productos sirven luego como plantilla para una reacción de desplazamiento de hebra cebada con BIP en los ciclos posteriores, una parte del cual se denomina paso de elongación y reciclaje, ilustrado en la mitad derecha de la Figura 1 A. Por lo tanto, en LAMP la secuencia objetivo es amplificado 3 veces cada medio ciclo. Los productos finales son una mezcla de ADNs de tallo-bucle con varias longitudes de vástago y como-coliflor estructuras con múltiples bucles formados por recocido entre las repeticiones alternativamente invertidas de la secuencia diana en la misma cadena. El paso siguiente es la amplificación mediada por las horquillas, en donde solo se emplean los cebadores internos. Este proceso se inicia en la región libre de la horquilla del producto formado en el paso anterior. Un cebador interno comenzará a amplificarse y en ese proceso abrirá la horquilla, provocando que la doble hebra formada se separe. Esta separación causa que se forme una horquilla en uno de los extremos de la cadena separada, debido a las regiones complementarias que posee; la cual comenzará a amplificarse y desplazará la primera amplificación producida por el cebador interno. Obteniéndose como resultado una hebra del doble de tamaño y otra del mismo tamaño que la inicial, pero con una horquilla en el otro extremo de la cadena. Estos dos productos pasan por el mismo proceso continuamente produciéndose al final varios productos de distintos tamaños y las hebras iniciales (Figura 4C).