Microbiología de alimentos específico sobre Staphylococcus aureus

1. Staphylococcus
aureus

2. Taxonomía, Manual de Bergey 1986
Dominio: Bacteria
Reino: Eubacteria
División: Eumicetes
Clase: Bacilli
Orden: Bacilliales
Familia:
Micrococcacea
Géneros: Planococcus
Micrococcus
Stomatococcus
Staphylococc

3. Staphylococcu
s
ESPECIE CAUSA DE ENFERMEDAD
S. aureus Común
S. epidermidis Común
S. saprophyticus Común
S. haemolyticus Infrecuente
S. lugdunensis Infrecuente
S. schleiferi Infrecuente
S. saccharolyticus Rara
S. warneri Rara
S. hominis Rara
S. auricularis Rara
S. xylosus Rara
S. simulans Rara
S. capitis Rara
S. cohnii Rara

4. Estafilococos
 Actualmente 33 especies, 17
encontradas en muestras clínicas
humanas.
 Staphylococcus aureus es el
patógeno más importante de la
familia.
 Oportunista.

5. ESTRUCTURA FUNCION
Cápsula Inhibe la opsonización y fagocitosis
Peptidoglicano Estabilidad osmótica, estimula la producción de
pirógenos endógenos. Inhibe la fagocitosis y la
quimiotaxis. Atrae químicamente a LPMN y la
lisozima lo hidroliza.
Proteína A Se une a receptores Fc de IgG. Inhibe la
opsonización y la fagocitosis. Anticomplemento.
Ac. Teicoico Polisacáridos específicos de especie. Regula la
concentración catiónica en la membrana celular.
Receptor para bacteriófagos. Sitio de adherencia
para receptores en superficies mucosas
Membrana
citoplásmica
Barrera osmótica, regula el transporte hacia y desde
la célula. Donde se encuentran localizadas las
enzimas biosintéticas y respiratorias

6. Factores de virulencia
◦ ENZIMAS
 Coagulasa
 Catalasa
 Hialuronidasa
 Fibrinolisina
 Lipasa
 Nucleasa
 Penicilasa
◦ TOXINAS
 Citolisinas( α, β, δ, γ,
leucocidinas)
 Exfoliativa
(epidermolítica)
 Síndrome Shock
tóxico
 Enterotoxinas (A-E)
◦ OTROS
 Producción de Limo
 Cápsula
 Pared celular

7. Factores de virulencia presentes en S.
aureus
PRODUCTO EFECTO DE LA ENZIMA
β -lactamasas Cofieren resistencia a los antibióticos β -lactámicos
DNAsas Favorecen la diseminación de la bacteria
Lipasas Hidrolizan membrana celular, favorecen invasión de tejidos cutáneos
y subcutáneos
Hemolisinas γ Citotóxica para eritrocitos
Hemolisinas δ Citotóxica para eritrocitos, leucocitos
Hemolisina β (Esfingomielinasa
C)
Citotóxica para eritrocitos, leucocitos, macrófagos y fibroblastos
Hemolisina α Citotóxica para eritrocitos, leucocitos, plaquetas. Dermonecrótica.
Leucocidina Daña los leucocitos y genera granulocitopenia
Hialuronidasa Hidroliza los enlaces glucosídicos del ac.hialunónico facilitando la
diseminación
Coagulasa Forma una capa de fibrina sobre el absceso, protegiendo de
fagocitosis. Activa al complemento
Catalasa Neutraliza los radicales libres producidos por LPMN
•Patogenicidad: Capacidad de un microorganismo para causar enfermedad. Se usa para describir o comparar especies
• Virulencia: Grado de patogenicidad de un microorganismo. Se usa para describir o comparar cepas dentro de una especie

8. Los integrantes del género
Staphylococcus, son cocos
Gram positivos, de 0.5-1.5 μm
de diámetro, catalasa
positivos, que se encuentran
microscópicamente aislados,
en pares, tétradas o formando
racimos irregulares (término
derivado del griego staphylé:
racimo de uvas, Ogston,
1883).
Son inmóviles,
facultativamente
anaerobios, no formadores
de esporas, generalmente
no capsulados o con
limitada formación de
cápsula.
Es una especie muy sensible a
la acción del calor y de los
desinfectantes.

9. El género Staphylococcus
está ubicado junto a los
géneros Micrococcus,
Planococcus y
Stomatococcus en la
Familia Micrococcaceae.
Staphylococcus aureus,
especie coagulasa
positiva, es un
reconocido patógeno
humano, siendo agente
etiológico de un amplio
espectro de infecciones
de origen comunitario y
nosocomial.

10. Toxinas
 Ciertas cepas del género Staphylococcus
pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus
ocasionan brotes de intoxicaciones alimentarias, debido
a que producen en los alimentos que contaminan ciertas
toxinas, que reciben el nombre de enterotoxinas.
 Se conocen varios tipos de enterotoxinas: tipo A, tipo
B, tipo C, tipo D y tipo E. Posiblemente existan más
tipos según apuntan las investigaciones que se están
llevando a cabo en la actualidad.
 La pepsina destruye las enterotoxinas a un pH próximo
a 2, pero no a pH más altos.

11.  Las enterotoxinas A y B
resisten temperaturas de
hasta los 100ºC, pero no las
temperaturas más elevadas
que se utilizan en la
pasteurización de la leche,
posteriormente sometida a
deshidratación no destruye la
enterotoxina B preformada,
ni la enterotoxina A en
crema utilizada para fabricar
mantequilla. En ambos casos
puede producirse intoxicación,
incluso cuando los
microorganismos hayan
muerto durante la
pasteurización.
 Las dosis tóxicas de las
enterotoxinas varían mucho,
debiéndose en parte a las
diferencias individuales en
cuanto a sensibilidad.

12. Toxinas
 Cada una de estas toxinas es conocida por sus potentes
efectos en células del sistema inmune. Cada una de estas
exotoxinas exhiben al menos tres propiedades biológicas:
◦ Pirogenicidad.
◦ Superantigenicidad, que se refiere a la habilidad de estas exotoxinas de
estimular la proliferación de linfocitos T sin tener en cuenta la
especificidad antigénica de estas células.
◦ Aumento de sensibilidad a la acción de endotoxina en modelos
experimentales en conejo.
 Las enterotoxinas son potentes agentes eméticos que están
históricamente relacionadas con un cuadro bien definido que
es la intoxicación alimentaria por Staphylococcus
aureus.
 Son producidas en la fase exponencial del desarrollo y los
genes que las codifican se encuentran en plásmidos,
bacteriófagos o elementos genéticos heterólogos, referidos
como islotes de patogenicidad.

13. Aspectos clínicos
 La contaminación de alimentos por S. aureus, está asociada
con una forma de gastroenteritis que se manifiesta
clínicamente por un cuadro caracterizado por vómitos (76%
de casos) y diarrea (77% de casos). El corto período de
incubación de 1-6 horas orienta a la sospecha de
enfermedad producida por ingestión de una o mas
enterotoxinas preformadas en el alimento que ha sido
contaminado con cepas de S. aureus productor de la misma.
 Son raramente observados signos de toxicidad sistémica,
tales como fiebre e hipotensión.
 En general, es un cuadro autolimitado que típicamente se
resuelve en 24- 48 horas desde el inicio.
 El 99% de casos de intoxicación alimentaria por
enterotoxinas estafilocóccicas está asociado a S. aureus y
ocasionalmente se reportan casos por Staphylococcus
epidermidis.

14. Tratamiento
 Como para la
mayoría de las
enfermedades
trasmitidas por
alimentos
autolimitadas, las
medidas de
sostén son la
base del
tratamiento. No
está indicado
tratamiento con
antimicrobiano.

15.  La enfermedad estafilocócica trasmitida por
alimentos resulta de la ingestión de
enterotoxinas termoestables preformadas por
una cepa toxigénica de Staphylococcus aureus
que contaminó y desarrolló en el alimento.
 Generalmente ocurren brotes,
predominantemente en verano, y el organismo
responsable es generalmente aislado de
personas involucradas en la preparación del
alimento.
 La incidencia es desconocida, pero es
probablemente una de las causas de
enfermedad trasmitida por alimentos mas
frecuentes.

16.  Los alimentos más
frecuentemente implicados en
la intoxicación estafilocócica
son principalmente los
proteicos (carne, pollo,
pescado, lácteos, cremas y
natas de pastelería) y en
particular: alimentos
cocinados que se
recontaminan
posteriormente (se ha
eliminado la flora competitiva y
se produce contaminación
post-cocinado), alimentos de
Aw reducida por adición de
azúcar o sal (cremas y
natas), productos cárnicos
curados tratados
térmicamente (jamón cocido)
y embutidos crudos

17.  S. aureus está presente en el aire,
polvo, agua, leche, superficies y
utensilios de trabajo de
industrias alimentarias y
cocinas, hombre y animales. El
hombre y los animales son el
reservorio primario de este
microorganismo. Los estafilococos
están presentes en las fosas
nasales, garganta, piel y pelo del
50% o más de los individuos
sanos.
 Esta incidencia es aún mayor en
aquellas personas que están en
contacto con individuos
enfermos o con ambientes
hospitalarios. La principal fuente
de contaminación de los alimentos
son los manipuladores, aunque
en algunos casos también se
produce contaminación a partir del
equipo.

18.  Por eso su presencia en
determinados niveles en los
alimentos es un signo evidente
de falta de higiene en la
manipulación.
 No todas las cepas de S.
aureus son capaces de
producir la intoxicación
estafilocócica. Solo las cepas
que producen una
enterotoxina y se conocen
como S. aureus
enterotoxigénico.

19.  La intoxicación se produce por el consumo de
alimentos en los que se ha multiplicado S. aureus
enterotoxigénico y ha producido toxinas en el
propio alimento. Es necesario que S. aureus
enterotoxigénico se encuentre en niveles de al
menos 106 /g para que se produzca suficiente
cantidad de toxina para provocar síntomas en el
consumidor.
 Estas cifras de 106 /g se alcanzan con facilidad si
los alimentos una vez elaborados no se
mantienen a temperaturas adecuadas (o
refrigeración o por encima de 60ºC) o bien si se
almacenan durante demasiado tiempo.

20.  Las intoxicaciones
alimentarias producidas
por las enterotoxinas
estafilocócicas
constituyen un problema
mundial y guardan
estrecha relación con los
hábitos alimentarios
regionales. La ingestión
de una dosis de menos
de 1.0 microgramo de
enterotoxina en un
alimento contaminado
produce los síntomas de
la enfermedad.

21.  Las enterotoxinas son proteínas de cadena
simple no ramificada, son solubles en agua y
presentan una alta termoestabilidad.
 Las enterotoxinas estafilocócicas son producidas
por cepas muy específicas; sin embargo, una de
ellas es capaz de sintetizar más de un serotipo de
enterotoxinas.
 7 enterotoxinas que se designan A, B, C1, C2, C3,
D y E. La enterotoxina del serotipo A es la que con
más frecuencia aparece en los brotes de
intoxicación alimentaria y le siguen en orden
decreciente las de los serotipos C1, B, D y E.

22. Condiciones de crecimiento de S.
aureus
Mínimo Óptimo Máximo
Temperatura (ºC) 10 40-45 48
pH 4,5 7-8 9,6
Actividad del Agua 0.87 0.89 0.99

23. Método de recuento en placa
 El método de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el
alimento por analizar contiene más de 100 S. aureus por gramo.
Material
 Pipetas de 1 estériles
 Estufa de cultivo
 Asa de vidrio estéril
 Asa de cultivo
 Placas de Petri de 90 mm de diámetro
Medios de cultivo y reactivos
 Medio sólido selectivo Baird Parker (B-P)
 Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI)
 Plasma de conejo con ácido Etilen diamino tetraacético (EDTA)
 Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la
prueba de la coagulasa

24. Preparación de la muestra
 Asépticamente se
pesan 10 g de
muestra en una bolsa
Stomacher

25.  Se diluyen en 90 mL
de agua peptonada

26.  Homogenizar la mezcla en
el Stomacher durante 1 a
4 minutos (el tiempo varía
segun el tipo de alimento)
(defectivamente realizarlo
por trituración en un vaso
esterilizado de una
trituradora de cuchillas -
tipo batidora- a una
velocidad aproximada de
14.000 rpm y en un
tiempo medio de 60-90
segundos).

27. Preparación de las diluciones
decimales
 Según el número de
microorganismos
esperado y sobre la base
de la dilución inicial de 10
g en 90 mL (dilución 10-1),
preparar diluciones
decimales de 10-2, 10-3,
etc., usando pipetas o
puntas estériles para cada
dilución, tomando 1 mL de
la solución anterior en 9
mL de agua peptonada, y
evitando que se forme
espuma.

28.  Mezclar
mecánicamente cada
dilución en un agitador
mecánico tipo vortex (o
manualmente agitando
el tubo 25 veces en 7
segundos con
movimientos
ascendentes y
descendentes
formando un ángulo de
abertura aproximado
de 60º entre brazo y
antebrazo).

29. Siembra por extensión en
superficie
 A partir de la "serie de
diluciones decimales",
y por duplicado, se
siembra 0,1 mL de
cada dilución sobre la
superficie bien seca
de agar Baird-Parker
contenido en placas
de Petri

30.  Diseminar con
asa de vidrio
estéril (asa de
Driglasky).

31. Incubación de las placas
Invertir las placas
de Petri e
incubarlas en estufa
a 37ºC durante 48
horas, con lectura a
las 24 horas.

32. Lectura de las placas y recuentos
de colonias
 Seleccionar para el
recuento las placas
inoculadas con la
dilución que
contengan entre 20 y
200 colonias típicas.

33.  El aspecto de las colonias
típicas de Staphylococcus
aureus sobre agar Baird-
Parker es el siguiente:
redondas, de bordes lisos,
convexas, de 2-3 mm de
diámetro, húmedas,
brillantes, negras, con un
borde blanco fino,
rodeadas de una zona
opaca y de un halo claro de
2-5 mm.
El cloruro de litio y el
telurito potásico que
forman parte del medio
inhiben el desarrollo de la
flora competitiva; el
piruvato sódico y la
glicocola favorecen el
crecimiento de los
estafilococos.

34.  El medio de cultivo es opaco,
debido a que se le incorpora
emulsión de yema de huevo. S.
aureus sintetiza una lipasa que,
al actuar sobre la lipoproteína de
la yema de huevo, produce un
aclaramiento alrededor de las
colonias. Alrededor de las
colonias se forma también una
zona opaca como consecuencia
de la formación de un precipitado
de sales de calcio y magnesio,
insoluble en ácidos grasos. Esta
zona opaca se hace más visible a
partir de las 24 horas de
incubación.
El aclaramiento del medio que
rodea a las colonias junto con el
color negro brillante de las
mismas, son las características
típicas mas visibles de las
colonias típicas.
Las colonias que no presentan
ese color negro brillante o que no
tienen alrededor un halo claro de
lipólisis son consideradas atípicas
y desechadas.
Colonias típicas
Colonias atípicas

35. Recuento de colonias sospechosas.
 Seleccionar para el recuento aquellas
placas que contengan entre 20 y 200
colonias típicas. Una vez contadas
estas colonias en las placas elegidas
se deben hacer pruebas
confirmativas, en particular la prueba
de la coagulasa. Si las colonias
contadas son coagulasa positivas
entonces expresaremos el recuento
como ufc/g de S. aureus coagulasa
positivo.
Para ello la cifra obtenida en las
placas se multiplica por el factor de
dilución de la placa, lo que da como
resultado el recuento total de S.
aureus coagulasa positivo en 0,1
gramo del producto analizado. Esta
cifra, multiplicada por 10, expresa el

36. Cálculos:
 En las placas que se ha
efectuado el recuento,
multiplicar por el inverso de la
dilución y expresar el
resultado como Unidades
Formadoras de Colonias por g
de alimento (UFC/g).donde:
 N= Unidades formadoras de
colonia por gramo de muestra
(UFC/g o UFC/mL).
 C= Media del número de
colonias en las dos placas.
 D= Factor o inverso de la
dilución. Expresión de los
resultados:
 Media del número de colonias
típicas en las dos placas x
inverso de la dilución x 10 =
UFC/g o UFC/mL
N = C x D x 10

37. Confirmación con la prueba de la
coagulasa
 Se seleccionan, como
minino, dos colonias
típicas para su
confirmación. Con
este fin, se investiga
la capacidad de la
cepa en estudio para
producir Coagulasa.

38.  Siembra en BHI
para realizar la
prueba de la
coagulasa
 Las colonias típicas
seleccionadas se
siembran en caldo
infusión cerebro-
corazón (B.H.I.
Brain Heart
Infusion) contenido
en tubos.

39.  Incubar a 37 ºC
durante 18-24 horas
Añadir 0,1 mL del
cultivo sobre Plasma
de Conejo
 En un tubo de 10 x 75
mm se vierten 0,3 mL
de plasma de conejo
EDTA reconstituido.
Se añade 0,1 mL del
cultivo obtenido en
caldo BHI.

40. Coagulasa
Incubar a 37ºC durante
6 horas
La reacción es positiva
cuando el coágulo
formado es firme
La reacción es negativa
cuando no se cuagula
el plasma.

41. Termonucleasa
Acido desoxiribonucleico------------ 0.3g
Cloruro de calcio----------------------0.0011g
Cloruro de sodio-----------------------10g
Azul de o-toluidina ( solución 1%)--9,2ml
pH: 9
Staphylococcus + termonucleasa 100oC
15´ Termonucleasa
MEDIO
+
DNA
+
Azul o-tol.
Destrucción DNA
+ Azul o-toluidina ROSADO

42. Prueba de DNAsa
 Las muestras dispuestas en BHI
fueron sometidas a un tratamiento
térmico punto de ebullición por 15
min para identificar cepas
termorresistentes, posteriormente
se realiza una siembra gruesa en
el medio DNAsa. Después de la
incubación del medio con la cepa
de prueba, las cepas que resistien
al tratamiento térmico y crecen en
el medio se les adiciona
abundante ácido clorhídrico 1N, el
cual precipita el ADN polimerizado
y hace que el medio se torne
opaco, cuando el microorganismo
sembrado degrada el ADN
produce una zona transparente
alrededor de la colonia y se lee
Prueba DNAsa positivo para S.
aureus

43. Staphylococcus aureus

44. Rev Méd Chile 2002; 130: 859-864. Portación de Staphylococcus
aureus enterotoxigénicos en manipuladores de alimentos. Guillermo
Figueroa G, Paola Navarrete W, Maricela Caro C, Miriam Troncoso H,
Gustavo Faúndez Z.
El estudio de susceptibilidad a antibióticos de las 35 cepas de S aureus aisladas mostró que
todas las cepas fueron resistentes a penicilina. Todas las cepas fueron sensibles a la acción
de la oxacilina, vancomicina, clindamicina, kanamicina y linezolid.

45. Detección de la enterotoxina A de Staphylococcus
aureus mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y su correlación con las
pruebas de coagulasa y termonucleasa
 El presente trabajo pretende detectar por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa la presencia del gen
que codifica para la enterotoxina A en un grupo de cepas de
Staphylococcus aureus aisladas de alimentos, así como
correlacionar la presencia de este gen con la producción
de las enzimas coagulasa y termonucleasa.
 Se analizaron 69 cepas de estafilococos, 58 provenientes de
muestras de leche no pasteurizada y 11 de la colección del
Laboratorio de Alimentos y Aguas de la Facultad de
Microbiología de la Universidad de Costa Rica.
 Los resultados demuestran que no existe correlación entre
las tres variables, no obstante, todas las cepas coagulasa
positivas fueron termonucleasa, pero no así a la inversa y
todas las cepas enterotoxina positiva son también
coagulasa y termonucleasa positivas, no así a la inversa.

46. Comparación de los resultados obtenidos para las
pruebas de coagulasa, termonucleasa y enterotoxina
A por PCR
Coagulasa Termonucleasa Enterotoxina A
Número de
muestras
positivas
24/69 46/69 7/69
Porcentaje (%) 35 67 10,14
Lo anterior pone de manifiesto el que utilizar pruebas
presuntivas o indirectas para evidenciar enterotoxigenicidad en
cepas de S. aureus no es confiable y por lo tanto es
recomendable realizar el análisis directo de éstas utilizando
técnicas altamente sensibles y específicas, como es el PCR.

47.  Gandra et al. señalan que especies como
S. intermedius y S. hyicus también son
tanto coagulasa como termonucleasa
positivas por lo que en una detección
indirecta de enterotoxinas éstas resultarían
en falsos positivos.
 Por otro lado, Jablonsky y Bohac añaden el
que la situación se complica con la
aparición de nuevas cepas
enterotoxigénicas, pero coagulasa
negativas, las cuales podrían considerarse
variantes o mutantes de las especies S.
aureus productoras de enterotoxinas.