La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite amplificar segmentos pequeños de ADN. Involucra la desnaturalización del ADN, la hibridación de cebadores y la extensión mediante una ADN polimerasa, lo que genera millones de copias del fragmento de interés en unas pocas horas. Se utiliza ampliamente en investigación, diagnóstico médico y aplicaciones forenses.

1. Polyerase Chain Reaction

2. Técnica empleada para la amplificación de segmentos
pequeños de DNA
Técnica de replicación in vitro, realizada a partir de
pequeñas cantidades de DNA y es catalizada por la
enzimas DNA polimerasa.
En ella se realiza una amplificación: Generar millones de
copias de un de segmento de DNA .

3. Premio Nobel de Química en1993
“ Vamos a tomar un
fragmento de DNA en el
que estés interesado y
obtener cuanto quieras de
este”
Dr. Kary Mullis, 1990

4.  Investigación
 Rastreo de mutaciones
 Establecimiento de polimorfismos de secuencia
 Preparación de muestras para secuenciación de ácidos nucleicos
 Diagnóstico clínico
 Detección de microorganismos infecciosos
 Determinación de secuencias especificas de ADN relacionadas con
situaciones patológicas definidas
 Diagnóstico de enfermedades genéticas
 Resolución de problemas forenses o arqueológicos

5. DNA recuperado de:
Humanos o animales (sangre, piel, cabello, saliva,
tejidos de órganos).
Plantas
Bacterias
Virus
Insectos

6. Un ciclo de PCR consiste en las siguientes etapas:
1.- Desnaturalización
2.- Alineamiento (Hibridación)
3.- Elongación (Extensión)

7. 1.- DNA Molde (Muestra de
DNA extraído).

8. 2.-Iniciadores (Primers)
Diseñados para unirse a secuencias específicas de DNA,
para iniciar la síntesis de una copia del fragmento de DNA
de interés.
Usualmente tienen una extensión de 20 nucleótidos.

9. 3.- Nucleótidos
Adenina, Timina, Citosina, y Guanina (A, T, C y G) son los
“bloques de construcción ” para formar los productos de
PCR.

10. 4.- Polimerasa de DNA
Une los nucleótidos individuales
para formar el producto de PCR.
Usualmente se utiliza a la Taq
Polimerasa

11. 1.-Termoestabilidad: Tolerar temperaturas de aprox. 95°C.
2.-Velocidad de Extensión: nucleótidos/segundos. Por lo
general pueden añadir 4kb por minuto.
3.-Procesividad: Capacidad de elongar una cadena de DNA
por muchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que
forma con el sustrato.
4.-Fidelidad

12. Fidelidad: Exactitud durante la replicación. Las
polimerasa pueden contar con mecanismos de
“proofreading” y actividad exonucleasa 3’-5’ para retirar
nucleótidos incorporados incorrectamente.

13. Taq Polimerasa (Taq Pol)
Extraída de la bacteria Thermus aquaticus
Su temperatura óptima de actividad es de 75-80°C.
Vida media de 2 horas a 92.5°C, 40 min a 95°C y 9 min
97.5°C.
Puede añadir 1000 pb en menos de 10 segundos a 72°C

14. Hot-Start
Evitan la amplificación de productos no específicos

15. Polimerasas de Alta Fidelidad (Hi-Fi)
Tienen capacidad “proofreading” y exonucleasa.
Polimerasas para Amplificación de Productos Largos
Productos de más de 5 kb
Enzimas diseñadas para tener una alta procesividad y
fidelidad. Permiten la amplificación de fragmentos de más
de 20 kb en pocas horas y enzimas que tiene una fidelidad
100 vece mayor que las Taq Polimerasas.

16. 5.- Buffer
50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 8.0).
Mg: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM.
Es un cofactor para la función de la polimerasa

17. Separación de la doble hebra de DNA mediante calor.
94-98°C, 1-3 min
Durante esta etapa, los puentes de hidrógeno entra las
bases se rompen y con esto, se separan las hebras del DNA.

18. Unión de los iniciadores (Forward y reverse) a sus
secuencias complementarias en el DNA de la muestra
(A=T; G=C).Flanquean la región de interés y permite
iniciar la síntesis de la cadena de DNA.
Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T), 0.5-2 min

19. La DNA polimerasa incorpora nucleótidos en el extremo 3´
del iniciadores hasta formas el fragmento de interés.
Es la etapa de amplificación propiamente dicha
70–75°C
¡La síntesis siempre ocurre en el sentido 5´3´!

20. Una PCR consiste en entre 30-40 ciclos, y las nuevas copias
generadas en un ciclo sirven de molde para la amplificación
del siguiente , por lo que el número de copias del fragmento
crece exponencialmente

22. Termocicladores

24. Usualmente se realiza en un gel de electroforesis.
Los fragmentos de DNA se desplazan a través de un gel
aplicando una corriente eléctrica y los fragmentos son
separados por tamaño.

27. Para incrementar la eficiencia y especificidad
Se realizan dos rondas de PCR
Ronda 1: Amplificar un fragmento en el que se encuentra tu
amplicon de interés.
Ronda 2: Amplificación de la región precisa que se desea
amplificar.

28. Utiliza diversos pares de iniciadores para diferentes
secuencias diana.
Permite ahorrar tiempo, reactivos y muestras.
El diseño de los iniciadores es crítico

30. Método que permite determinar la cantidad presente de la
secuencia diana en una muestra. Este es posible mediante
la detección de fluorescencia.
Combina la amplificación de DNA con la
detección, teniendo lugar en un mismo tubo. El
fluoróforo está presente constantemente en la
reacción y la señal obtenida al final de cada
ciclo de amplificación se representa en una
gráfica frente al número de ciclos y se obtiene
una curva que muestra el transcurso del
proceso.