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Actividad antiviral de engystol
- 1. ACTIVIDAD ANTIVIRAL DE ENGYSTOL: UN ANALISIS IN VITRO Urías Hernández, Linda Rios, Amilkar Rodríguez
- 2. INTRODUCCION Influenza VRS Rinovirus Tratamiento Amandatina Inh de la neuraminidasa Análogos de nucleosidos Engystol ®
- 3. INTRODUCCION OBJETIVO: Estudiar los efectos de la preparación homeopática Engystol® en un panel de virus patógenos humanos in vitro.
- 4. INTRODUCCION Presentación: Comprimidos y solución inyectable. Ingredientes activos: Vincetoxicum hirundinaria y azufre. Otros estudios: asociado con estimulación del sistema inmunitario en términos de la actividad fagocítica, la función de granulocitos, y una mejor respuesta humoral. Sin embargo, todavía no está claro si estos efectos son mediada por las propiedades inmunoestimulantes de Engystol o si Engystol por sí mismo tiene actividad antiviral directa. Presente estudio investigo una actividad antiviral de engystol en un panel de virus patógenos humanos ARN Y ADN Rinovirus, influenza A, VRS, Herpes simple tipo 1, adenovirus Estimulación potencial de la actividad antiviral celular por inducción del sistema de interferón por Engystol. ENGYSTOL ®
- 5. MATERIALES Y METODOS Sustancia de ensayo • Formulaciones comercialmente disponibles de Engystol® • Se suministran de forma gratuita por el fabricante como ampollas estériles Fármacos de referencia • Aciclovir, ribavirina, y clorhidrato de amantadina fueron utilizados como controles positivos. Células y virus • Rinovirus humano se obtuvo del instituto de virología de la universidad de Friedrich Schiller de Jena, Alemania • VSR, Influenza, H1N1, VHS, Adenovirus se obtuvieron del instituto de higiene de la Universidad de Tubingen Alemania
- 6. MATERIALES Y METODOS Ensayos del virus Inmunoensayos Ensayo de placa Titulaciones del virus Ensayo de citotoxicidad Invitro: ensayo enzimático Microscopio: cultivos celulares Ensayos para actividad antiviral Reducción de placas Cultivo celulares
- 7. MATERIALES Y METODOS Determinación de la infectividad de los virus recién sintetizado Controles Elisa y titulaciones del virus para dosis infecciosa en cultivo: Cuando las dosis de infección fueron demasiado alta para permitir la evaluación de los títulos de virus mediante ensayo de reducción de placa 1. Control de células 2. Control del virus
- 8. ¿EN RESUMEN? Preparación homeopática • Vincetoxicum hirundinaria • Azufre Menos EA y eficaz en el Tto de infecciones virales y respiratorias. ¿¿Estimulación la actividad fagocítica, la función de granulocitos, y una mejor respuesta humoral VS antiviral?? • RVH • V. influenza A • VSR • Adenovirus 5 • VHS 1 Panel de VH patógenos: ARN y ADN con y sin envoltura.
- 9. ¿EN RESUMEN? HEP VSR Adenovirus 5 VHS 1 HeLa RVH Células Canine Kidney Madin Darby V. influenza A CITOTOXICIDAD • Ensayo enzimático • Microscopio: Cultivos ANTIVIRAL • Reducción de placa. • Casos y controles TITULACIÓN DE VIRUS • Ensayos de placa • ELISA • TCID 50
- 10. LA CUANTIFICACIÓN DE INTERFERÓN DE TIPO I EN EL CULTIVO CELULAR DE CÉLULAS TRATADAS CON ENGYSTOL.Engystol se añadió en un sistema libre de células en diluciones de 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16, 1:32, 1:64, 1: 640, y 1: 6,400 a un alto título de adenovirus suspensión durante 120 minutos a 34 ° C y 5% de CO2. Engystol se añadió en diluciones de 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16, 1:32, y 1: 320 a las células sensibles de virus. ANÁLISIS DE LA INFLUENCIA ANTIVIRAL DIRECTA DE ENGYSTOL EN ADENOVIRUS.
- 13. RESULTADOS Citotoxicidad de HEP y células MDCK fue baja. No hubo citotoxicidad con Engystol, ya sea en ensayos de MTT o en exámenes microscópicos a una dilución de 1: 2 para las células HEP y dilución de 1: 4 para las células MDCK. Morfología celular: HEP y MDCK no se vio afectada por el tratamiento. Células HeLa tratadas con las sustancias de ensayo diluidas mostraron viabilidad similar a los controles no tratados.
- 14. RESULTADOS Reducción de placa 22%: HRV 14 Alta concentración de Engystol reducción de 37% en placas de VSR. No hubo efecto de Engystol en virus de influenza A, ni en el ensayo de reducción de placas, ni en el ensayo de titulación de punto final
- 15. RESULTADOS Adenovirus Ensayo de placa Inhibición del 73% de las proteínas adenovirales TCID50: Disminución del 57% en la infectividad de la descendencia de adenovirus. HSV-1 Ensayo de placa: Dilución de 1: 2 se asoció con una reducción del 80% en las proteínas virales. Dilución de 1:16: Reducción de 28%. TCID50: La dilución más baja de Engystol condujo a una inhibición de 64% y una dilución de 1:16 dio lugar a una reducción de 20%
- 16. DISCUSIÓN Se indica actividad antiviral específica dosis- dependiente de Engystol, evaluada por ensayos de reducción de placa y análisis de infectividad. Inhibición ~80% Adenovirus Virus herpes simple-1 MAYORES EFECTOS Inhibición 20-30% Virus sincitial respiratorio A ALTAS CONCENTRACIONES
- 17. EXPLICACIONES ALTERNATIVAS Una posible heterogeneidad entre las preparaciones (un riesgo con los preparados homeopáticos y herbales) Una dosis muy baja de virus en los ensayos Una interacción directa de Engystol con ADN-virus Un efecto antiviral indirecto de Engystol por inducción del sistema antiviral celular de Interferón
- 18. DISCUSIÓN Los resultados fueron muy similares con dos lotes diferentes de Engystol, lo que indica la homogeneidad entre las preparaciones. Los diferentes títulos de virus mostraron resultados similares para los ensayos de punto final de titulación, y en ELISA, lo que indica que el efecto no es dependiente de la dosis de virus. La preincubación de adenovirus con Engystol produjo una inhibición de la proteína de la cápside en ELISA, sin reducir infectividad del virus. Se necesita un análisis detallado para aclarar la naturaleza de los cambios en la cápside por el agente homeopático.
- 19. DISCUSIÓN Es una cuestión abierta en qué medida los efectos antivirales directos observados pueden ser responsables de los beneficios clínicos. Las concentraciones de los componentes activos de Engystol en los experimentos actuales no son directamente comparables con los del agente usado clínicamente. ¿El grado de inhibición observado es suficiente para dar cuenta de los efectos clínicos de la infección viral?
- 20. CONCLUSIÓN Si se puede demostrar de manera concluyente que Engystol, tiene efectos antivirales, esto sería una adición bienvenida a las opciones de tratamiento para las infecciones virales. Este trabajo apoya un efecto directo del agente homeopático Engystol en una variedad de virus humanos, evaluado en ensayos específicos. Se necesita más trabajo para establecer una explicación de los efectos a nivel molecular y evaluar la relevancia de los resultados in vitro en la práctica clínica.
Notas del editor
- Muchos virus respiratorios, más comúnmente influenzavirus, virus respiratorio sincitial (VRS) y rinovirus, son capaces de causar enfermedades respiratorias, ya sea por sus efectos directos o exacerbando condiciones subyacentes. Un número de sustancias están disponibles para el tratamiento eficaz de las infecciones virales, tales como amandatine, inhibidores de la neuraminidasa, y análogos de nucleósidos. Sin embargo, muchas sustancias antivirales están asociadas con efectos secundarios y hay todavía una necesidad de sustancias antivirales con buena eficacia y tolerabilidad, y baja toxicidad. La preparación homeopática Engystol® (Biologische Heilmittel Heel GmbH, Baden Baden, Alemania) se utiliza con frecuencia en la medicina complementaria para el tratamiento profiláctico de enfermedades infecciosas.
- Engystol se utiliza en la forma de comprimidos o en solución para inyecciones y contiene dos ingredientes activos principales, Vincetoxicum hirundinaria (swallowort), que se ha asociado con la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped, y azufre, que se ha utilizado homeopáticamente para el tratamiento de una gama de condiciones, incluyendo enfermedades de la piel, inflamaciones agudas y crónicas, y hepática y trastornos gastrointestinales. El remedio ha demostrado ser eficaz en varios ajustes clínicos para el tratamiento de infecciones virales y respiratorias. Otros estudios han indicado tratamiento Engystol estar asociados con una estimulación del sistema inmunitario en términos de la actividad fagocítica, la función de granulocitos, y una mejor respuesta humoral. Sin embargo, todavía no está claro si estos efectos son mediada por las propiedades inmunoestimulantes de Engystol o si Engystol por sí mismo tiene actividad antiviral directa. El presente estudio investigó una posible actividad antiviral de Engystol en un panel de virus patógenos humanos, incluyendo ARN y virus de ADN: rinovirus humano (HRV); un virus de ARN de cadena simple sin cubierta; dos envuelto virus de ARN, virus de influenza A y RSV; y dos virus de ADN, herpes simple tipo 1 (HSV-1), que pertenece a envuelto virus de ADN, y de adenovirus, un virus de ADN que carece de una membrana externa. Además de un efecto directo de Engystol en células infectadas por virus, se investigó la estimulación potencial de la actividad antiviral celular por inducción del sistema de interferón por Engystol.
- Sustancia de ensayo Formulaciones comercialmente disponibles de Engystol® (lote 06959 11-2006; E1, y lote 09203 08-2008; E2) se suministran de forma gratuita por el fabricante como ampollas estériles (1,1 ml H2O). La composición se indica en la Tabla 1. En todos los experimentos, se diluyeron las sustancias de ensayo en un medio de cultivo celular antes de que se añadieron a los cultivos celulares. Fármacos de referencia Aciclovir (Zovirax, ® Deutsche Wellcome GmbH, Burgwedel, Alemania), ribavirina (Virazole, ® ICN Pharmaceuticals, Frankfurt, Alemania), y clorhidrato de amantadina (amantadina, Ratiopharm, Ulm, Alemania) fueron utilizados como controles positivos. Aciclovir fue utilizado en las infecciones con HSV 1, la ribavirina con el VRS, la amantadina y la gripe Un virus. Estos reactivos se diluyeron en función de su en la citotoxicidad in vitro. Las células y los virus Rinovirus humano 14 (VFC 14) se obtuvo del Instituto de Virología de la Universidad Friedrich Schiller de Jena, Alemania. RSV, (cepa Long), 1/83 virus de la gripe A / Chile (H1N1), HSV 1 (cepa Thea), y adenovirus (adeno 5) se obtuvieron a partir del antiguo Departamento de Virología Médica y Epidemiología de Enfermedades Virales del Instituto de Higiene de la Universidad de Tübingen, Alemania. Se identificaron todos los virus y se caracterizaron con un panel de anticuerpos monoclonales (BioWhittacker productos, Walkersville, MD). RSV, adenovirus, y cepas de HSV se propagaron en células epiteliales humanas (HEP); HRV en las células HeLa en / medio esencial mínimo de Earle de Hank (MEM) que contiene 2% de suero fetal de ternero, MgCl2 25 mM, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina. Influenza A se cultivó en Madin-DarbyCanine-Kidney células (MDCK) con MEM libre de suero que contiene 1 g / ml de tripsina, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina.
- Los ensayos de virus Los inmunoensayos enzimáticos (de virus / Serion, Würzburg, Alemania; Merlin Diagnostika GmbH, Bornheim-Hersel, Alemania; Dako, Hamburgo, Alemania), ensayos de placa, y titulaciones de virus se llevaron a cabo utilizando procedimientos estándar. Los ensayos de placas y titulaciones de virus para la detección de partículas infecciosas se realizaron con cultivos de células MDCK, hep, y HeLa. Los ensayos de citotoxicidad Los análisis de la citotoxicidad in vitro de las sustancias de ensayo se realizó con células fisiológicamente activas mediante un ensayo enzimático (MTT-ensayo) como described15 y por el examen microscópico de los cultivos celulares para la morfología celular alterada. Los ensayos para actividad antiviral Ensayo de reducción de placas. Determinación de la actividad antiviral de Engystol contra la influenza, RSV y HRV se realizó con ensayos de reducción de placa. monocapa de células se infectaron durante 1 hora a 34 ° C con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,0002 (Influenza A, HRV) o 0.0004 (RSV) sin o en presencia de diferentes diluciones no tóxicos de la sustancia de ensayo y el respectivo controles. Los cultivos celulares se cultivaron hasta que las lesiones fueron visibles en la monocapa de células (placas) del grupo de control cultivadas en medio solo, se fijaron con paraformaldehído, y las monocapas de células restantes se tiñeron con una solución de cristal violeta. Las placas se cuantificaron con un sistema de evaluación óptica.
- Determinación de la infectividad de los virus recién sintetizado preparaciones (ensayos de titulación de virus). Cuando las dosis de infección fueron demasiado alta para permitir la evaluación de los títulos de virus mediante ensayo de reducción de placa, la cantidad de virus recién sintetizados se determinó ya sea por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o mediante titulaciones de virus para dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID) 50 valores. Líneas de células sensibles de virus fueron infectadas con los sobrenadantes derivados de los cultivos tratados de sustancias y los respectivos 100 diluciones de 1 hora a 34 ° C. Posteriormente, el medio se reemplazó por agarosa semisólida y se cultivaron las células durante otros 3-4 días hasta que las placas eran visibles en los grupos de control no tratados. Controles. Una serie de controles se incluyeron en los ensayos para la determinación de la actividad antiviral: células no infectadas (control de células); las células infectadas; o células cultivadas en medio sin agente antiviral o sustancia de ensayo (control de virus).
- Vincetoxicum hirundinaria (swallowort), que se ha asociado con la estimulación de los mecanismos de defensa del huésped, y azufre, que se ha utilizado homeopáticamente para el tratamiento de una gama de condiciones, incluyendo enfermedades de la piel, inflamaciones agudas y crónicas, y hepática y trastornos gastrointestinales. El remedio ha demostrado ser eficaz en varios ajustes clínicos para el tratamiento de infecciones virales y respiratorias. incluyendo ARN y virus de ADN: rinovirus humano (HRV); un virus de ARN de cadena simple sin cubierta; dos envuelto virus de ARN, virus de influenza A y RSV; y dos virus de ADN, herpes simple tipo 1 (HSV-1), que pertenece a envuelto virus de ADN, y de adenovirus, un virus de ADN que carece de una membrana externa
- Los análisis de la citotoxicidad in vitro de las sustancias de ensayo se realizó con células fisiológicamente activas mediante un ensayo enzimático (MTT-ensayo) como describe y por el examen microscópico de los cultivos celulares para la morfología celular alterada. Ensayo de reducción de placas. Determinación de la actividad antiviral de Engystol contra la influenza, RSV y HRV se realizó con ensayos de reducción de placa. monocapa de células se infectaron durante 1 hora a 34 ° C con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,0002 (Influenza A, HRV) o 0.0004 (RSV) sin o en presencia de diferentes diluciones no tóxicos de la sustancia de ensayo y el respectivo controles. Los cultivos celulares se cultivaron hasta que las lesiones fueron visibles en la monocapa de células (placas) del grupo de control cultivadas en medio solo, se fijaron con paraformaldehído, y las monocapas de células restantes se tiñeron con una solución de cristal violeta. Las placas se cuantificaron con un sistema de evaluación óptica.
- Citotoxicidad de HEP y células MDCK fue baja. No hubo citotoxicidad con Engystol, ya sea en ensayos de MTT o en exámenes microscópicos a una dilución de 1: 2 para las células HEP y dilución de 1: 4 para las células MDCK. La (IC) 50 de Engystol en células MDCK calculados a partir de varios experimentos era una dilución de 1: 1,5. Morfología celular: HEP y MDCK no se vio afectada por el tratamiento. Células HeLa tratadas con las sustancias de ensayo diluidas mostraron viabilidad similar a los controles no tratados.
- No hubo efecto de Engystol en virus de influenza A, ni en el ensayo de reducción de placas (Fig. 1A, derecha), ni en el ensayo de titulación de punto final
- infectados cultivos de células en experimentos de punto final de titulación HSV-1: Ensayo de placa: Dilución de 1: 2 se asoció con una reducción del 80% en las proteínas virales. Dilución de 1:16: Reducción de 28%. TCID50: La dilución más baja de Engystol condujo a una inhibición de 64% y una dilución de 1:16 dio lugar a una reducción de 20%
- Aunque el último es un bastante bajo grado de inhibición, los experimentos fueron consistentes y reproducibles. Los efectos sobre HSV y Adeno-5 fueron similares a las de la sustancia de control CPC (Cethylpyridiniumchloride). HSV-1: VIRUS HERPES SIMPLE 1 HRV: RINOVIRUS HUMANO RSV: VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO HFF: FIBROBLASTOS DE MUCOSA HUMANA HEP: CELULAS EPITELIALES HUMANAS CPC: Cethylpyridiniumchloride UV: ULTRAVIOLETA IFN: INTERFERON ADENO-5: ADENOVIRUS
- una posible heterogeneidad entre las preparaciones (un riesgo con los preparados homeopáticos y herbales); una dosis muy baja de virus en los ensayos; una interacción directa de Engystol con ADN-virus; o un efecto antiviral indirecta de Engystol por inducción del sistema antiviral celular IFN.
- Los resultados fueron muy similares con dos lotes diferentes de Engystol, lo que indica la homogeneidad entre las preparaciones. Los diferentes títulos de virus mostraron resultados similares para los ensayos de punto final de titulación, y en ELISA, lo que indica que el efecto no es dependiente de la dosis de virus. La preincubación de adenovirus con Engystol produjo una inhibición de la proteína de la cápside en ELISA similar a la de CPC pero sin reducir la infectividad de la suspensión del virus. Esto indica que Engystol interactúa con la cápside del virus, que afecta a la estructura de proteínas de la cápside para enmascarar o alterar el epítope específico del virus, pero sin afectar a la infectividad. Se necesita un análisis detallado para aclarar la naturaleza de los cambios en la cápside por el agente homeopático.
- Por último, la explicación alternativa de una inducción mediada por Engystrol de células IFN fue puesta a prueba en las células HEP y HFF con suspensiones de virus inactivado-UV. Engystol fue incapaz de mejorar niveles de IFN en este ensayo. Por lo tanto, parece muy probable que los efectos observados son el resultado de un verdadero efecto antiviral de Engystol.