Este documento describe diferentes técnicas para el estudio de la célula a nivel microscópico, como la microscopía óptica, electrónica, citometría de flujo y difracción de rayos X. También explica métodos para fraccionar componentes celulares como la centrifugación diferencial y en gradiente de densidad.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
CLASE 1: TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LA
CELULA
Blga. ROSA MARIA LIÑAN ABANTO

2. MICROSCOPIA
 Técnica que permite
producir imágenes de
objetos y detalles
demasiados pequeños
para ser percibidos por la
vista.
 Permite conocer como
es la forma, tamaño y
estructura de la célula
 Puede ser M. óptica y M.
electrónica.

4. EVOLUCION DE LA MICROSCOPIA

7. MICROSCOPIA OPTICA:
Se basa en el uso de lentes ópticos y un haz luminoso
para generar imágenes amplificadas de un objeto.
Utiliza como herramienta al microscopio de luz

8. LA LUZ

9. EL MICROSCOPIO OPTICO
 Es un instrumento que sirve para
aumentar el tamaño de un objeto a
través de un sistema de lentes.
 Utiliza como fuente de energía
(radiación) a la luz.
 Tiene como función además de generar
una imagen magnificada (amplificada)
del objeto y apreciar detalles del mismo,
es decir que debe tener resolución.

10. Amplificación:
Genera una imagen de mayor tamaño que
el objeto real,
 Se determina mediante el producto del
número de aumentos del objetivo por los
del ocular.

11. Poder de resolución
Capacidad de distinguir, separar detalles
pequeños.

12. Limite de resolución
menor distancia que puede haber entre
dos puntos para ser distinguidos como
dos entidades independientes.

13.  El límite de resolución de una lente
puede calcularse utilizando la ecuación
de Abbé:

15. Medidas utilizadas en biología celular
mm = milésima parte de un metro (10-3 m)
µm = milésima parte de un mm ( 10-3 mm)
nm = milésima parte de un µm ( 10-6 mm)
A° = 0.1 nm ( 10-7 mm)

16. TIPOS DE MICROSCOPIA DE LUZ
M. de campo claro:
En este tipo de microscopía la imagen es obtenida por
simple transmisión de la luz a través del preparado.
La luz debe atravesar la muestra, esta puede ser un
aplastado, un dispersado o un corte muy delgado del
espécimen.
Si las muestras no poseen contraste, el mismo se genera
mediante la tinción del espécimen, utilizando colorantes
que poseen afinidad por distintos elementos celulares.

18. M. de campo oscuro
Es un microscopio óptico ordinario cuyo sistema
condensador ha sido modificado para dirigir la luz
a la preparación.
Se basa en que los rayos de luz que alcanzan al objeto
son tan oblicuos con relación al eje óptico que no
llegan a pasar directamente por el objetivo.
Se utiliza para determinar movilidad en cultivos

19. M. de contraste de fases
Se basa en los distintos índices de refracción para la luz
de los distintos componentes celulares.
Este tipo de microscopía es la elegida para seguir el
transcurso de ciertos procesos biológicos ya que permite
la observación de células vivas y no es necesario fijar y
teñir la muestra para generar contraste.

21. COLORACIONES CITOLOGICAS
 Tinción hematoxilina / eosina es la tinción de rutina más común,
utiliza colorante básico (hematoxilina) y un colorante ácido (eosina). Las
sustancias de naturaleza ácida (como los ácidos nucleicos) tienen
afinidad por los colorantes básicos como la hematoxilina. Por el
contrario, las sustancias de naturaleza básica (la mayor parte del
citoplasma) tienen afinidad por la eosina. Fig A

22.  Tinción con la técnica de PAS (Ácido peryódico schiff) : para
demostración de glúcidos. Por ejemplo para observar glicocálix y
mucina. Fig. C
 Método de Feulgen: para demostración de DNA. Fig. D
 Técnica del rojo grasa Sudan : para demostrar lípidos en células.
Fig. E

23. CITOMETRÍA DE FLUJO:
 Esta técnica permite la medida simultánea de
múltiples características físicas de una célula.
Estas medidas son realizadas mientras las células
pasan en fila a una velocidad de 4 000 – 5 000
células / seg. a través del aparato de medida en
una corriente de fluido.
 Ventajas su alta sensibilidad y análisis
independiente a cada célula.
 Desventajas no se puede visualizar a las células
que se analizan, no proporciona información de la
localización celular en tejido.

24. DIFRACCION DE RAYOS X
 Consiste en hacer atravesar un haz fino de rayos X sobre
el material que se analiza y colocar detrás una placa
fotográfica que recoge el espectrograma
 Se basa en que las radiaciones se difractan al encontrar
pequeños obstáculos .
 Ventajas:
• proporciona mayor resolución que las técnicas mas
perfeccionadas de microscopia electrónica.
• Usa muestras gruesas y sin tratar por el elevado poder de
penetración de los rayos X.
 Desventajas:
• Solo se utiliza cuando el material observado posee estructuras
periódicas (cadenas de ADN)
• Estructuras cristalizadas

27. AUTORRADIOGRAFIA
 Esta técnica se basa en la sensibilidad de las emulsiones
fotográficas a las radiaciones ionizantes
 Aplicaciones: estudio del ciclo celular
 Si, por ejemplo, se quiere saber qué células de un tejido están
sintetizando DNA como un paso previo a la división celular, se
suministra timidina tritiada (3H) al tejido durante algún tiempo.
Durante ese período, en todo el DNA sintetizado por las células de
ese tejido se incorporará la timidina marcada radiactivamente.
 Al tomar muestras del tejido (p. ej., cortes histológicos), si la
lámina que contiene el corte se recubre de una emulsión
fotográfica, en ésta quedará una impresión producida por las
radiaciones emitidas por la timidina tritiada, que activan los
cristales de bromuro de plata de la emulsión. Al revelar
fotográficamente esta emulsión, aparecerán gránulos negros de
plata sobre los núcleos que han que han sintetizado DNA durante
el período de administración de la timidina radioactiva

28. Marcaje radiactivo con timidina tritiada de un cultivo de
células . Las células que se encontraban replicando el DNA
durante la administración de la timidina radiactiva aparecen
marcadas con gránulos negros. X900. (Cortesía de M.P. de
Miguel)

29. CITOMETRÍA DE FLUJO:
 Esta técnica permite la medida simultánea de
múltiples características físicas de una célula.
Estas medidas son realizadas mientras las células
pasan en fila a una velocidad de 4 000 – 5 000
células / seg. a través del clitómetro en una
corriente de fluido.
 Ventajas su alta sensibilidad y análisis
independiente a cada célula.
 Desventajas no se puede visualizar a las células
que se analizan, no proporciona información de la
localización celular en tejido.

30. FRACCIONAMIENTO SUB CELULAR:
Conjunto de métodos y técnicas que tiene como
objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas
de un determinado componente celular.
Implica una:
 Homogeneización de células o
tejido
 Centrifugación del homogenato

31. Homogeneización de la muestra:
Se trata de la RUPTURA CONTROLADA de tejidos y
células.
Se debe asegurar no provocar cambios irreversibles en
los componentes celulares.
• Medio isotónico o levemente hipotónico Sacarosa
0.25M
• pH 7.4
• No usar soluciones salinas con alto poder iónico
• Siempre trabajar en frío

32. METODOS DE HOMOGENIZACION:

33. Centrifugación del Homogenato
 Se basa en el movimiento de una partícula en el seno
de un líquido cuando es sometida a un movimiento
circular que genera una fuerza centrífuga.
 Puede ser por:
• Diferencial:
• Centrifugación en gradiente de densidad

34. CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL:
 La separación se realiza en función de su coeficiente de
sedimentación (S)
 Se obtienen dos fracciones: Un pellet con material
sedimentado y un sobrenadante con el material no
sedimentado
Desventaja: nunca se obtienen fracciones puras

36. Coeficiente de sedimentación de componentes subcelulares:

37. CENTRIFUGACION EN GRADIENTE DE DENSIDAD
Permite la separación de todos los componentes de la
muestra, también permite realizar medidas analíticas.
Este método implica la utilización de un soporte fluido
cuya densidad aumenta desde la zona superior a la
inferior
RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2