La citometría de flujo permite el análisis multiparamétrico de células individuales en suspensión mediante la detección de luz dispersada y fluorescencia emitida por cada célula cuando pasa a través de un haz de láser. Esto proporciona información sobre las características morfológicas y marcadores inmunológicos de subpoblaciones celulares, lo que tiene aplicaciones en investigación e diagnóstico clínico.

1. 1 Citometría de flujo
1. Introducción
La citometría de flujo es una tecnología que se utiliza con mucha frecuencia en Inmunología y en el análisis de células sanguíneas
o Hematología. Sin embargo, tiene aplicaciones en muchas áreas como en Biología celular y molecular, Microbiología,
Toxicología, Farmacología, etc. Se utiliza tanto en investigación básica como en el diagnóstico clínico.
2. Fundamento
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una
suspensión de células alineadas de una en una, por delante de un haz de luz láser.
El citómetro recoge información de cada célula individual basada en la dispersión de la luz de las células que se están
analizando y si la muestra está marcada con un fluorocromo se puede analizar la fluorescencia emitida.
(flurorocromo: moléculas que emiten fluorescencia con una longitud de onda determinada cuando se le irradia con rayo láser)
Si empleamos anticuerpos conjugados con un fluorocromo, mediante reacciones antígeno anticuerpo, se puede marcar la
superficie celular y determinar estructuras determinadas localizadas en la membrana, en el citoplasma o en el núcleo. La
caracterización de las células según los marcadores inmunológicamente activos que hay en su superficie se denomina
Inmunofenotipo.
3. Objetivos
1. Identificar y enumerar subpoblaciones celulares únicas y definidas.
2. Seleccionar y separar físicamente subpoblaciones de células deseadas
(acoplamiento con un citómetro separador).
3. Medir la capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas.
4. Ventajas e Inconvenientes
 Análisis de un alto número de número de células en un corto tiempo
 Alta Sensibilidad (detecta subpoblaciones minoritarias)
 Análisis multiparamétrico
- Se necesita células individuales en suspensión
- Equipos son caros y se requiere formación para utilizarlo.
5. Información
Nos da información multiparamétrica de cada célula individual dentro de una población que puede ser heterogénea. Es decir,
podemos identificar una subpoblación minoritaria dentro de una población mayor heterogénea, sin necesidad de separar.
En función de la luz dispersada , los parámetros que podemos medir son: 1. tamaño celular, 2. complejidad o granulosidad celular
3.Fluorescencia
6. Componentes de un citómetro de flujo
El citómetro de flujo es un sistema combinado de los siguientes componentes:
1. Sistema de fluidos: Es un sistema que permite transportar la muestra hacia el haz de luz láser de una en una. Consta de un
inyector de muestra y de una cámara de flujo. En esta cámara se produce un flujo laminar al interaccionar dos fluidos, el de la
muestra y un fluido envolvente (disolución buffer pH= cts) que rodea la muestra. Por diferencias de presión, la muestra penetra por
el centro de la cámara de flujo sin mezclarse con el fluido envolvente y las células salen por el tubo alineadas y pasan de una en
una ante el rayo láser. El punto de interacción entre el haz láser y la muestra se denomina punto de interrogación y siempre debe
ser constante.
2. Sistema óptico: Irradia las partículas de la muestra (fuente de luz) y cada célula que atraviesa la fuente de luz (láser) genera
una señal (dispersión de la luz, fluorescencia) que es recogida por detectores. Como fuente de luz se utiliza lámparas de alta
luminosidad ( de Hg o Xe), láser de alta potencia (De Ar con λ= 488 nm, de He-Ne con λ= 633 nm). Como detectores se utiliza
fotodetector como fotomultiplicador y se utiliza filtros para eliminar y separar la luz recogida. Los filtros de absorción son capaces
de absorben ciertas λ y dejar pasar otras y los filtros dicroicos no absorben la luz sino que refleja aquella luz que tiene λ que no es
la que deja pasar.
3. Sistema electrónico: convierte las señales de luz en señales electrónicas con el fin de poder interpretar los datos.
7. Lectura de las señales
Las señales producidas por la interacción de las células con el haz de luz son de dos tipos: de dispersión y de fluorescencia.
1. Señales de dispersión: La dispersión se produce cuando la luz interacciona con un partícula y cambia de dirección en todas
las direcciones del espacio sin variar la longitud de onda. Estas señales dan información de las características morfológicas como

2. 2 Citometría de flujo
el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular del interior de la célula, llamado complejidad. Se puede medir dos
tipos:
 La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección de la luz incidente, llamada FSC
(Forward Scatter). Es una medida proporcional al tamaño de la partícula que produce la dispersión.
 La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional a la complejidad de la estructura interna
de la partícula.
2.Señales de Fluorescencia: solo si la célula está marcada por un fluorocromo como fluoresceína (verde) y/o picoeritrina (rojo).
La fluorescencia se mide mediante un detector situado a un ángulo de 90 ºC.
Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud
superior (menor energía). El espectro de absorción o excitación es el rango sobre el que un fluorocromo absorbe luz, y el espectro
de emisión es el rango sobre el que un fluorocromo emite luz.
Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Debido a que parte de la
energía se utiliza para la absorción, la luz emitida es de menor energía que la luz de excitación, es decir la longitud de onda
emitida es mayor. La diferencia entre la longitud de onda de absorción y emisión se denomina Stokes shiff.
Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con
un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad
de componentes fluorescentes de la partícula.
8. Análisis de datos:
Aunque el citómetro mide las células individuales analiza la muestra de forma colectiva. Los datos generados se laman
citogramas o histogramas. Pueden ser monoparamétricos que analiza el número de células frente a un solo parámetro o
biparamétrico (dot-plot) cada célula se encuentra en una posición en función de dos parámetros. Por ejemplo: ermite determinar
las tres poblaciones de leucocitos en base a sus propiedades en una muestra de sangre.
La gran ventaja es que podemos analizar las células en subgrupos celulares llamados gate, que se pueden analizar en sucesivos
dot-plot con el fin de analizar e identificar células que se encuentran una proporción muy minoritaria dentro de una muestra muy
completa
Cómo se realizan las mediciones en la citometría de flujo?
A. Sobre determinados grupos de células.
B. Sobre cada célula.
C. Sobre un promedio de la población.
D. Sobre una selección de células.
Qué es la citometría de flujo?
a. Una técnica de análisis de poblaciones celulares en suspensión.
b. Un método para la separación celular que no requiere componentes magnéticos, sino microesferas de plástico no magnéticas.
c. Una técnica que elimina las poblaciones celulares no deseadas mediante la capacidad lítica del complemento.
d. Un método de separación celular sencillo, desarrollado para el fraccionamiento de linfocitos T y B.
Qué nombre reciben y a qué se refieren los dos parámetros físicos de las células que se cuantifican con el citómetro de flujo?
a) Forward scattering (dispersión lateral a 0 grados) y side scattering (dispersión frontal a 90 grados).
b) Forward scattering (dispersión frontal a 0 grados) y side scattering (dispersión lateral a 90 grados).
c) Forward scattering (dispersión frontal a 90 grados) y side scattering (dispersión lateral a 0 grados).
Forward scattering (dispersión lateral a 90 grados) y side scattering (dispersión frontal a 0 grados
Qué sistema de los que componen el citómetro de flujo contiene filtros para eliminar y separar la luz recogida?
a) El sistema de iluminación.
b) El sistema hidráulico.
c) El sistema electrónico.
d) El sistema óptico.