Este documento describe varios métodos para el aislamiento y purificación de proteínas, incluyendo la centrifugación, cromatografía por exclusión de tamaño, intercambio iónico y electroforesis. Explica cómo estas técnicas separan las proteínas basadas en sus propiedades físicas como tamaño, carga eléctrica y solubilidad.

1. Tema 2: Estructura y Función de las Proteínas (5/5) Prof. Vanessa Miguel [email_address] @bioquitips Noviembre 2011 Universidad Central de Venezuela Facultad de Medicina Escuela de Medicina Luis Razetti Cátedra de Bioquímica

2. ¿Cómo se estudian las proteínas?

4. Aislando fracciones subcelulares

8. Purificación de proteínas

9. Métodos de purificación Se basan en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas: Tamaño Solubilidad Carga Adsorción Afinidad

10. Característica Procedimientos Tamaño Diálisis – ultrafiltración Electroforesis en gel Cromatografía de exclusión molecular Ultracentrifufación Solubidad Precipitación con Sales “ Solventes orgánicos ‘’ por pH Polaridad Cromatografia de absorción C. En papel C. En fase reversa C. De interaccion hidrofóbica Carga Cromatografia de intercambio iónico Electroforesis Isoelectroenfoque Selectivida d Cromatografia de afinidad

11. Centrifugación Utiliza la fuerza centrífuga (fuerza-g) para aislar partículas suspendidas. Los componentes de la mezcla se separan por: peso , tamaño , densidad y forma. Se utiliza para la separación de organelos subcelulares y para el aislamiento de macromoléculas, tales como ADN, ARN, proteínas o lípidos Se separan es su coeficiente de sedimentación ( s ); medido en Svedbergs (1 S = 10 -13 segundos), depende de la forma y el tamaño de la molécula o partícula .

13. Centrifugación Centrifugación en gradientes de densidad Gradientes continuos de sacarosa  tubo de centrífuga

14. Aplicación de fuerza centrífuga

17. Fundamento de la cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fase móvil Fase estacionaria Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla se separan Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria

18. Cromatografía Exclusión molecular: Separa según tamaño molecular Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados Fase móvil: solución buffer Intercambio iónico: Separa según carga eléctrica Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble Fase móvil: gradiente de sal o de pH

19. Exclusión molecular Separa mezclas de proteínas por tamaño Las columnas rellenas de polímeros inertes insolubles pero muy hidratados: Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

20. Exclusión Molecular A: Pasa s ólo por fuera de las perlas Menos recorrido, sale primero B: Pasa por dentro y por fuera de las perlas Mayor recorrido, Sale después Resina porosa Fase estacionaria Amortiguador Fase m óvil Resina B A

21. Exclusión molecular

22. Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la columna Vo

23. Exclusión Molecular 1 . La column a se equilibra con el buffer de corrida 2. Aplicación de la muestra ( 0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elu c i ó n. .

24. Cromatografía en columna La salida de las proteínas se detecta normalmente por absorción de la luz, en una longitud de onda de 280nm. Los aminoácidos de las proteínas absorben tal luz y se cuantifica utilizando un espectrofotómetro, Los datos se registran en un diagrama de elución que indica la posición de las proteínas que se han separado. Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de las proteínas fraccionadas

26. Cromatografía de intercambio iónico

27. Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil ( contraiónes ) , estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos. Matriz Nombre Dextrano Sephadex Agarosa Sep h arose CL-6B Celulosa Sephacel

28. Intercambio Iónico Los grupos funcionales cargados son una propiedad fundamental del intercambiador. Determinan el tipo y la fuerza del intercambiador El número total y su disponibilidad, determinan la capacidad del intercambiador Los de carga negativa adsorben cationes (intercambiadores catiónicos) mientras que los de carga positiva adsorben aniones (intercambiadores aniónicos)

29. Intercambiadores aniónicos

30. Intercambiadores catiónicos

31. Intercambio iónico Mecanismo de separación Separa a moléculas por carga neta. Grupos cargados unidos a la matriz unen las muestras de carga opuesta(reversible) La elución se logra a través el camb i o del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente. Fig 1.1. Charged sample molecules adsorb to ion exchangers of the opposite sign. The interaction is a dynamic equilibrium that can be influenced by pH or salt concentration.

32. Cromatografía de intercambio iónico Retenidas por la resina Para separar A de la resina es necesario cambiar el pH por arriba del pI Resina carga (-) Atrae cationes A: (+) B: (-)

33. - Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas + + + + + + + + + - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

35. Electroforesis Método de separación de sustancias cargadas al aplicar un campo eléctrico, de modo que se diferencian en el diferente comportamiento en un campo eléctrico. Aquellas partículas cargadas positivamente (cationes) migrarán hacia el cátodo y las cargadas negativamente (aniones) hacia el ánodo .

36. 1. Se realiza sobre un soporte sólido o semisólido, para minimizar efectos de difusión 2. Se somete el conjunto a un campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migran conforme a su carga eléctrica 3. Terminada la electroforesis, las proteínas se tiñen con un colorante adecuado (ej., Azul de Coomassie) Muestra + - Ánodo Cátodo

37. Electroforesis de zona Papel de filtro o acetato de celulosa Revela la presencia de proteínas con colorantes específicos No existe interacción con el soporte Resolución muy baja Rápido

40. Electroforesis en geles de poliacrilamida Separa por carga y tamaño El material soporte interacciona con las proteínas actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes Utiliza geles de poliacrilamidas. Condicion nativa (PAGE) o desnaturalizante(SDS-PAGE)

41. Electroforesis

42. SDS-Page Las proteínas se separan s ó lo por su PM El SDS interacciona con las proteínas por interacciones hidrofóbicas Recubre las proteínas con carga negativa proporcional a su PM Desnaturaliza la estructura nativa de la proteína  -mercaptoetanol rompe los pu e ntes disulfuros

46. Electroforesis

47. Electroforesis bidimensional

48. Electroforesis: Aplicaciones Separar proteínas de una mezcla Determinación de PI y PM Fraccionamiento de las hemoglobinas Diferenciación de la hemoglobina fetal Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc Proteínas séricas Proteínas urinarias Lipoproteínas Ácidos nucleicos Enzimas Inmunoelectroforesis Etc .

49. Solubilidad Muy utilizados en los primeros pasos de la purificación Mantiene nativa a la proteina Redisolución sin pérdida de actividad Cada proteína tiene una composición de aa diferente y diferente solubilidad

50. Solubilidad Depende de: pH Fuerza iónica Disolvente Temperatura

51. Solubilidad-pH La carga neta de las proteína depende del contenido de aa ácidos y de aa básicos Cuando el valor del pH donde la carga neta de la proteína es cero  pI Solubilidad es mínina Ej:  contenido de aa ácidos  pI bajo (4-5)

52. Solubilidad: disolventes Adición de disolventes neutros miscibles en agua (ACETONA, ETANOL) Se usan en distintas proporciones Disminuyen la solvatación de las proteínas en soluciones acuosas

53. Solubilidad-Fuerza iónica Salting in Salting out

54. Salting in (salado) Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 – 0.02 M) aumenta con la [ sales]  Salting in Al aumentar la [sales]  proteína se rodea de contraiones  más soluble por > interacción proteína-solvente

55. Salting out (precipitación por salado) La solubilidad a alta fuerza iónica ( mayor a 0,02M) disminuye con la [sales]  Salting out La alta [sal] remueve la esfera de solvatación de la proteína y éstas precipitan

56. Solubilidad- Temperatura 0-40 o C >T > solubilidad. 40-50 o C aumenta la inestabilidad y DESNATURALIZAN (  solubilidad)