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Perspectiva del uso de la secuenciación masiva en el mundo vitivinícola
- 1. Perspectiva del uso de la secuenciación masiva en el mundo vitivinícola Carmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV 15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016
- 2. Indice Introducción de la microbiología del vino Secuenciación masiva (HTS) Aplicaciones de HTS en enología Perspectivas futuras de HTS en enología
- 3. Carácter del vino Uva • Variedad, cepa, prácticas cultivo • Clima, microclima, enfermedades Micro organismos • Microbiota de la uva • Inóculo • Microbiota de la bodega Procesado • Recogida, macerado, aditivos, condiciones de fermentación, lias • Clarificación, filtración Enveje cimiento • Composición, tiempo, Tª, pH, higiene, evaporación,O2 Introducción
- 4. Decisión de la bodega Grape Introducción Microorganismo Envejecimiento Procesado Uva Microorganismo Envejecimiento Procesado Uva Microorganismo Procesado Procesado Crianza Crianza Uva Microorganismo Uva
- 5. Microbiología del vino Levaduras: Fermentación alcohólica Azucares EtOH + CO2 LAB: Fermentación Maloláctica Ac. málico Ac. Láctico Deseables Introducción Sugars
- 6. Problema de contaminación Levaduras o bacterias: • Desestabilizan la fermentación • Producen malos olores o sabores • Refermentan en el producto embotellado Indeseables BACTERIAS Acetobacter Gluconobacter Bacillus Pediococcus Lactobacillus … LEVADURAS Brettanomyces Candida Pichia Zygosaccha. Schizosacch. …. Introducción
- 7. Métodos de detección alteraciones microbiológicas • Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa Confirmativos • Cultivo en placas de medios selectivos Incubación larga, VPNC, medios inadecuados • Técnicas moleculares basadas en ADN/ARN restricción del ADN mitocondrial PCR-RFLP PCR-RAPD PCR con cebadores específicos Pre-enriquecimiento PCR anidada Limitaciones qPCR Introducción
- 8. Métodos de detección alteraciones microbiológicas • Análisis sensoriales o de cromatografía gaseosa Confirmativos • Cultivo en placas de medios selectivos Incubación larga, VPNC, medios inadecuados • Técnicas moleculares basadas en ADN/ARN restricción del ADN mitocondrial PCR-RFLP PCR-RAPD PCR con cebadores específicos Pre-eriquecimiento PCR anidada Limitaciones qPCR Introducción Secuenciación Masiva HTS
- 9. Secuenciación masiva (HTS) Secuenciaciónmasiva(HTS) ADN genómico Fragmentación Identificación (Tag) Amplificación Secuenciación Análisis
- 11. Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS) Secuenciaciónmasiva(HTS) • Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema) • ADN de muestras prehistóricas • Secuenciación de genomas procariotas y eucariotas • Identificación de mutaciones (enfermedades) • Estudios comparativos (Metatranscriptómica) • Detección de alelos específicos del cancer • Epigenómica • Detectar ncRNA • …..
- 12. Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS) Secuenciaciónmasiva(HTS) • Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema)
- 13. Aplicaciones de secuenciación masiva (HTS) Secuenciaciónmasiva(HTS) • Metagenómica (mezcla de ADN dentro de un ecosistema) Investigar comunidades microbianas 16S procariotas 18S/ ITS eucariotas Alimentos Genes/funciones Estructura de la comunidad -Bebidas fermentadas -Carne -Leche -Queso…
- 14. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Bokulich et al., 2012. PLoS ONE 7(5): e36357. doi:10.1371/journal.pone.0036357 • Estudio pionero de HTS en enología realizado sobre vino Botritizado • Diversidad bacteriana mucho mayor a la descrita anteriormente • Influencia del uso de inoculo de S.cerevisiae sobre diversidad bacteriana
- 15. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Bokulich et al., 2013. PNAS. E139–E148, doi: 10.1073/pnas.1317377110 Las comunidades microbianas (bacterias y hongos) están influenciadas por la variedad de uva, región, clima y cosecha
- 16. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Pinto et al., 2014. PLoS ONE 9(1): e85622. doi:10.1371/journal.pone.0085622 • Procariotas y Eucariotas en las hojas de la vid a lo largo del ciclo vegetativo • Microbiología estructurada y dinámica (Enterobacteriaceae yAureobasidium) • Microbiota afectada por el tratamiento químico
- 17. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Zarraonaindia et al., 2014. mBio 6(2):e02527-14.doi:10.1128/mBio.02527-14 • El suelo es una fuente importante de bacterias asociadas a la vid • Los factores edáficos y las propiedades específicas del viñedo influyen la microbiología de la planta antes de la vendimia Mantel test r p pH 0.611 0.001 C:N 0.442 0.001 Carbon 0.158 0.001 Soil Temp 0.155 0.001 Moisture 0.125 0.005 Nitrogen 0.104 0.031
- 18. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63 • Los más abundantes en uva: Bacillales y Lactobacillaes • Diferentes grupos taxonómicos y proporción de los mismos (viñedo y variedad)
- 19. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63 • La variedad de uva y el viñedo influyen en la microbiota residente en los racimos • Factores como la orientación geográfica del viñedo marcan las diferencias en la composición bacteriana de las uvas dentro de una DO (Priorat)
- 20. Aplicaciones HTS en enología Aplicaciones Portillo et al., 2016. International Journal of Food Microbiology 219 (2016) 56–63 • Grupos taxonómicos compartidos por los distintos viñedos
- 21. Persperctivas de HTS en enología • Hasta ahora, uso principalmente ecológico • En el área de alimentos, monitorización de grupos • Recientemente, búsqueda de contaminantes Perspectivas Uso de HTS para la detección de contaminantes microbiológicos durante fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino
- 22. Persperctivas de HTS en enología • Hasta ahora, uso principalmente ecológico • En el área de alimentos, monitorización de especies • Recientemente, búsqueda de contaminantes Perspectivas Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino Ventajas -Descripción detallada de los microorganismos -Monitorización procesos normales/alterados -Identificación de nuevos alterantes -Posible efecto predictivo
- 23. Perperctivas de HTS en enología • Hasta ahora, uso principalmente ecológico • En el área de alimentos, monitorización de grupos • Recientemente, búsqueda de contaminantes Perspectivas Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino Desventajas -Coste aún elevado para bodegas -Requiere conocimientos bioinformáticos
- 24. Perperctivas de HTS en enología • Hasta ahora, uso principalmente ecológico • En el área de alimentos, monitorización de grupos • Recientemente, búsqueda de contaminantes Perspectivas Uso de HTS para la detección de contaminaciones microbiológicas durante fermentación, envejecimiento o tras el embotellado del vino Desventajas -Coste aún elevado para bodegas -Requiere conocimientos bioinformáticos Solución: Realizar análisis mediante servicios externos Ejemplo: Biome Makers
- 25. Gracias! Carmen Portillo Dept. Bioquimica i Biotecnologia, URV 15 Abril 2016XXVIIè CONGRÉS I LA NIT DE L’ENOLOGIA 2016
Notas del editor
- La fabricación de vino implica interacción microbiana en todas sus etapas, desde la recepción de materia prima hasta el embotellado. Algunas de estas actividades microbianas son deseables porque el proceso de producción de vino implica una fermentación llevada a cabo por levaduras y/o bacterias, pero otras pueden representar una amenaza para el correcto control del proceso y estabilidad del producto final.
- Existen distintos métodos de detección de alteraciones microbiológicas en el vino en tre los que destacanlos análisis sensoriales o de cromatgrafía de gases basados en la detecciónde los malos olores o sabores producidos por los microorganismos indeseados durante su crecimiento, conlo cual sería un método meramente confirmativo, pues detecta el problema porque ya ha habido crecimiento. Despues est el cultivo en placas con medio de cultivo específico. Estos métodos tienen el inconveniente de que son lentos pues la incubación hasta el crecimiento de los microorganismos es larga, pudiendo llegar hasta 9-10 días en el caso de algunos microorganismos de crecimiento lento. Además El fenotipo de VPNC se caracteriza por la incapacidad de las células de crecer en medio de cultivo aunque mantengan su actividad metabólica o celular de forma que pueden volver a ser cultivables cuando las condiciones ambientales sean favorables. Este fenómeno podría inducir a falsos negativos o infravaloración en placa de vinos con una considerable concentración de la levadura en este estado fisiológico, lo que supondría un riesgo para el vino analizado.No hay medios adecuados par todos los microorganismos pues es bien sabido que solo el 1% de los microorgasnimos soncultivables por las técnicas estándares de cultivo en laboratorio. Por último, con el uso de las técnicas moleculares basadas en la detección del ADN ARN extraido directamente de la muestra, se puede tener una detecciónmás rápida y evitando el problema de no poder cultivar el microorgasnimo para detectarlo. Estos son algunos ejemplos de técnicas usadas en la microbiología del vino, casi todos requieren un paso previo de enriquecimiento antes de la extracción deADN con lo que no seríancuantitativos y cada uno tiene sus limitaciones de detección. La qPCR si es cuantitativa, pero reuiere primers especificos para detectar los microorganismos que nos interesen, conlo que si no conocemos el microorgasnismo,no podemos detectarlo.
- Existen distintos métodos de detección de alteraciones microbiológicas en el vino en tre los que destacanlos análisis sensoriales o de cromatgrafía de gases basados en la detecciónde los malos olores o sabores producidos por los microorganismos indeseados durante su crecimiento, conlo cual sería un método meramente confirmativo, pues detecta el problema porque ya ha habido crecimiento. Despues est el cultivo en placas con medio de cultivo específico. Estos métodos tienen el inconveniente de que son lentos pues la incubación hasta el crecimiento de los microorganismos es larga, pudiendo llegar hasta 9-10 días en el caso de algunos microorganismos de crecimiento lento. Además El fenotipo de VPNC se caracteriza por la incapacidad de las células de crecer en medio de cultivo aunque mantengan su actividad metabólica o celular de forma que pueden volver a ser cultivables cuando las condiciones ambientales sean favorables. Este fenómeno podría inducir a falsos negativos o infravaloración en placa de vinos con una considerable concentración de la levadura en este estado fisiológico, lo que supondría un riesgo para el vino analizado.No hay medios adecuados par todos los microorganismos pues es bien sabido que solo el 1% de los microorgasnimos soncultivables por las técnicas estándares de cultivo en laboratorio. Por último, con el uso de las técnicas moleculares basadas en la detección del ADN ARN extraido directamente de la muestra, se puede tener una detecciónmás rápida y evitando el problema de no poder cultivar el microorgasnimo para detectarlo. Estos son algunos ejemplos de técnicas usadas en la microbiología del vino, casi todos requieren un paso previo de enriquecimiento antes de la extracción deADN con lo que no seríancuantitativos y cada uno tiene sus limitaciones de detección. La qPCR si es cuantitativa, pero reuiere primers especificos para detectar los microorganismos que nos interesen, conlo que si no conocemos el microorgasnismo,no podemos detectarlo.
- La secuenciación masiva o HTS de sus siglas en inglés High Througput sequencing consiste en la obtencion de miles de secuencias de ADN por muestra con la consiguiente liberación de información. Esto ha sido posible al desarrollo técnico e introducción de las primeras plataformas de secuenciación masiva que han posibilitado el descenso vertiginoso de los costes de secuenciación por cada megabase. Desde el 2008 no ha parado de bajar el coste haciendo accesible esta técnica a cualquier laboratorio de investigación y multiplicándose las posibilidades de su uso. La primera vez los científicos necesitaron 13 años y 3.000 millones de dólares para secuenciar el primer genoma humano. En la actualidad, puede secuenciarse en 2h por 1000 dolares con el PMG Ion Torrent. Esto hace que hoy en día HTS se use como rutina en muchos laboratorios, sobretodo de biomedicina.
- This study served as a pilot study for using barcoded amplicon next-generation sequencing to profile bacterial community structure in wines and grape musts. botrytized wine fermentations, revealing a broad diversity of low-abundance taxa not traditionally associated with wine. diversity between inoculated and uninoculated samples suggest that Saccharomyces inoculation exerts selective pressure on bacterial diversity in these fermentations, most notably suppressing abundance of acetic acid bacteria. These results determine the bacterial diversity of botrytized wines to be far higher than previously realized, providing further insight into the fermentation dynamics of these wines, and demonstrate the utility of next-generation sequencing for wine ecology studies. Samples from 2008 represented three separate batches, two inoculated with Saccharomyces cerevisiae (batches 1, 2) and one uninoculated (batch 3), as well as two press-pan samples collected following juice pressing. Samples from 2009 and 2010 represented one uninoculated batch each (batches 4 and 5, respectively).
- Mas de 250 muestras Chardonnay and Cabernet Sauvignon:demonstrate that regional, site-specific, and grapevariety factors shape the fungal and bacterial consortia inhabiting wine-grape surfaces. Furthermore, these microbial assemblages are correlated to specific climatic features, suggesting a link between vineyard environmental conditions and microbial inhabitation patterns.
- massive parallel rDNA sequencing, along its vegetative cycle. Among eukaryotic population the most abundant microorganisms belonged to the early diverging fungi lineages and Ascomycota phylum, whereas the Basidiomycota were the least abundant. Regarding prokaryotes, a high diversity of Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria was unveiled. Indeed, the microbial communities present in the vineyard during its vegetative cycle were shown to be highly structured and dynamic. In all cases, the major abundant microorganisms were the yeast-like fungus Aureobasidium and the prokaryotic Enterobacteriaceae. the chemical treatments also affect the grapevine microbiome and are responsible for the appearance of pesticide-resistant pathogen strains [8]. The chemical treatments affected the vineyard’s microbial population and the comparison among microbial community using Metastats [24] revealed differences between communities (r,0.05) (Figure 5a). In general, chemical treatments had a negative impact on the balance between phytopathogens and phytoprotectors in the V. vinifera microbiome (Figure S5), Herein, we report the first complete microbiome landscape of the vineyard, through a metagenomic approach, and highlight the analysis of the microbial interactions within the vineyard and its importance for the equilibrium of the microecosystem of grapevines.
- the spatial and temporal dynamics of the bacterial communities associated with grapevine organs (leaves, flowers, grapes, and roots) and soils were characterized over two growing seasons to determine the influence of vine cultivar, edaphic parameters, vine developmental stage (dormancy, flowering, preharvest), and vineyard. Belowground bacterial communities differed significantly from those aboveground, and yet the communities associated with leaves, flowers, and grapes shared a greater proportion of taxa with soil communities than with each other, suggesting that soil may serve as a bacterial reservoir. A subset of soil microorganisms, including root colonizers significantly enriched in plant growth-promoting bacteria and related functional genes, were selected by the grapevine. In addition to plant selective pressure, the structure of soil and root microbiota was significantly influenced by soil pH and C:N ratio, and changes in leaf- and grape-associated microbiota were correlated with soil carbon and showed interannual variation even at small spatial scales. Diazotrophic bacteria, e.g., Rhizobiaceae and Bradyrhizobium spp., were significantly more abundant in soil samples and root samples of specific vineyards. Vineassociated microbial assemblages were influenced by myriad factors that shape their composition and structure, but the majority of organ-associated taxa originated in the soil, and their distribution reflected the influence of highly localized biogeographic factors and vineyard management. Terrestrial microorganisms may indeed lead to regionalized properties associated with valuable crops.
- Taxonomic composition of the bacterial communities of grape must varied greatly across the selected vineyards (Fig. 1A) but predominantly consisted of the orders Bacillales (37.6%), Pseudomonadales (16.8%), Lactobacillales (14%), Enterobacteriales (11.6%) and Actinomycetales (3.4%)
- Grenache and Carignan, and compared them across five vineyards included within the Priorat region (Spain). We could detect up to 14 bacterial phyla with Firmicutes (37.6% Bacillales and 14% Lactobacillales), Proteobacteria (16.8% Pseudomonadales and 11.6% Enterobacteriales) and Actinobacteria (3.4% Actinomycetales) being themost abundant. Bacterial communitywas different at each vineyard being grape varietal, geographical situation and orientation related with changes in bacterial populations. The most abundant bacterial taxa and those driving differences between the vineyards and grape varietals were identified. This study indicates that bacterial community heterogeneities can be influenced by geographic factors like orientation.
- Biome Makers
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