Guión practicas de microbiologia

1. PRÁCTICAS
DE
MICROBIOLOGÍA GENERAL
2º de Grado de Biología
Almudena Fernández Villadangos

2. PRÁCTICA 5: BIOENSAYO (análisis de resultados).
1. Medir el diámetro de cada halo (mm).
2. Hacer recta patrón representando diámetro de halo (abcisas; eje
X) frente a log10 de la concentración de antibiótico (ordenadas; eje
Y).
3. Estimar la concentración de la solución problema de penicilina G
de forma gráfica o matemáticamente

3. PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados).
1.Medir el diámetro de cada halo (mm):
>15 mm microorganismo sensible
<13 mm microorganismo resistente
Bacitracina (Gram+)
Ampicilina (Gram + y algunas Gram -)
Kanamicina (Gram + y -)
E. coli (Gram -)
B. subtilis (Gram +)
Entre 13-15 mm: zona de incertidumbre (resultado no definitivo)
RESULTADOS EN COMÚN! DISCUSIÓN!

4. PRÁCTICA 6: ANTIBIOGRAMA (análisis de resultados).
El tamaño del halo puede estar influido por:
(i)el medio de cultivo: composición; temperatura de incubación.
(ii)la estabilidad del antibiótico;
(iii)La difusión del antibiótico en medio: grosor; % agar; volumen
de antibiótico; tamaño molecular.
(iv)Microorganismo: cantidad de inóculo microbiano; sensibilidad
al antibiótico.

5. PRÁCTICA 7: TITULACIÓN DE FAGOS (análisis de resultados).
1. Identificar los halos de lisis.
2. ¿Cómo ha sido la siembra? Homogénea, heterogénea,…
3. Elegir las placas de cultivo que tengan entre 30-200 halos para el
análisis y contamos los halos.
4. Calcular los títulos de la solución problema del fago λ:
Título viral
(UFP/ml)
promedio del número
de placas de lisis (UFP)
0.1 ml
x dilución=
5. Resultados en común y discusión:
¿Dónde hay más halos en LE392 + o -?

6. PRÁCTICA 8: PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Objetivos:
- Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas.
- Entender su utilidad.
- Visualizar los distintos resultados.
- Interpretar los resultados.
- Identificar microorganismos con pruebas miniaturizadas.
Pruebas bioquímicas:
-Se utilizan para la identificación, principalmente, de enterobacterias (Gram -; de interés
clínico) viendo una serie de pruebas fenotípicas y genotípicas y comprobando con las ya
clasificadas.
- En las reacciones bioquímicas se detectará la existencia de una enzima en concreto o
una vía metabólica.

7. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.
INDOL
Fundamento: detección de actividad triptofanasa (triptófano como funte de C o N)
Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido “caldo Indol” (medio con
peptonas y triptófano al 1%).
Triptofanasa: Trp  piruvato + amoniaco + indol
El indol se pondrá de manifiesto por la acción del reactivo de Kovacs [alcohol isoamílico,
para-dimetilamino-benzaldehido (PDAB) y ácido clorhídrico].
Realización de la práctica:
Añadir 6-8 gotas de reactivo de Kovacs para detectar la
presencia de indol en el medio.
Positiva: un producto coloreado (rosindol) se manifiesta
como un anillo rojo en la superficie del caldo.

8. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.
RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer)
Fundamento: detección de fermentaciones.
Crecemos el microorganismo en estudio en un medio líquido diferencial “caldo RMVP”
(favorece los procesos fermentativos a partir de la glucosa; peptonas, glucosa, fosfato a
pH7).
Prueba Rojo de metilo:
Detecta la realización de una fermentación ácido mixta (acidos: fórmico, acético, láctico y
butírico); mediante la detección de ácidos.
Prueba Voges-Proskauer:
Detecta la realizacion de una fermentación butiliendiólica o butilenglicólica; mediante la
detección de la producción de acetoína (intermediario de la fermentación butiliendiólica o
butilenglicólica).
La reacción positiva en una de estas pruebas implicará negatividad en la otra reacción
para el mismo microorganismo.

9. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.
Realización de la práctica: RM
Añadir 5-7 gotas de rojo de metilo (indicador de pH) para
detectar el cambio de pH del medio.
Positiva: el medio cambia de color a rojo.
[Mediante el rojo de metilo se detectará la producción de
ácidos (fermentación ácido mixta) que bajan el pH hasta 4]
RMVP (rojo de metilo y Voges-Proskauer)
Realización de la práctica: VP
Añadir 8-10 gotas de KOH 40% (para subir el pH) y 5 gotas
de α-naftol 5%.
Agitar suavemente.
Positiva: el medio cambia de color a rosa-rojizo.
(en alcalinidad y con oxígeno la acetoina se oxida a acetilo,
el cual con α-naftol se observa con un tono rosa-rojizo)

10. Pruebas IMViC: Indol, RMVP, agar Citrato de Simmons.
CITRATO
Fundamento: detección de actividad citrato permeasa (capacidad de introducir el citrato
al interior de la célula) y saber si utiliza citrato como fuente de carbono:
Citrato  CO2 + AcetilCoA + NH4
Creceremos el microorganismo en estudio en un medio “agar citrato Simmons” (medio
con citrato como única fuente de carbono, azul de bromotimol y fosfato amónico pH6.8).
Realización de la práctica:
Realizar una siembra en estría que cubra toda la placa a
partir del eppendorf con E. coli o E. aerogenes.
Crecer 30ºC 24 horas.
Positiva: crecimiento y cambio de color a azul (se introduce
el citrato en las células y se alcaliniza el medio: NH4).
Negativo: no crecimiento y no cambio de color (verdoso).

11. Prueba de la CATALASA:
Fundamento: detección de actividad catalasa.
catalasa: H2O2  H2O + O2
Realización de la práctica:
Forma I:
1.Coger 30 μl del eppendorf con E. coli o E. aerogenes y
añadirlos en un porta.
2.Añadir una gota de agua oxigenada.
Forma II:
1.Añadir 6-8 gotas de agua oxigenada sobre la placa petri
donde se encuentra el miroorganismo Proteus mirabilis.
Positiva: salen burbujas (liberación de oxígeno).

12. Prueba API20E:
Fundamento:
Es un sistema rápido de identificación de bacterias que consta de una serie de análisis
bioquímicos equivalentes a los indicados anteriormente y muchos otros que se realizan
de forma miniaturizada en cada uno de los pocillos de la tira de API.
Sistema rápido, eficaz, permite hacer diferentes pruebas bioquímicas a la vez.
Hay diferentes tipos de tiras API, por lo que necesitamos saber de antemano si el
microorganismo a identificar es Gram + o -, y su grupo bacteriano.

13. Prueba API20E:
Fundamento:
El sistema API20E es específico para enterobacterias (gram-):
con 20 microtubos o pocillos con sustratos deshidratados para 20 pruebas bioquímicas y E
de Enterobacterias.
El resultado genera un número (API Profile Index) de 7-9 dígitos que se incorpora a una
base de datos que nos dará una identificación microbiológica.
Number 1044552 --- Escherichia coli

14. Prueba API20E:
Realización de la práctica:
1.Resuspender en 5ml de NaCl 0.9% una colonia de 2-3 mm: asa de siembra y
mechero.
2.Rellenar los pocillos de la base del envase con agua sin que rebose (mantener
humedad).
3.Rellenar con la suspensión microbiana todos los pocillos de izquierda a derecha,
hasta la cúpula, sin que aparezcan burbujas.
4.Rellenar con la suspensión microbiana la cúpula de las pruebas CIT, VP y GEL.
5.Rellenar con aceite mineral las cúpulas de las pruebas ADH, 2DC, ODC, H2S y URE
(condiciones anaerobias).
6.Cerrar, rotular e incubar a 37ºC 24 horas.
Material:
-Tubo 10ml.
- Asa de siembra.
-Solución salina.
-Placa con colonias aisladas: E. coli, E. aerogenes o P. mirabilis.
-Agua milli Q.
-Aceite mineral.