Este documento describe el uso de la espectrofotometría UV-visible para determinar la concentración de leche en polvo en una muestra desconocida. Se construyeron curvas de calibración usando soluciones de leche en polvo en agua y en etanol al 40% como solvente. Los resultados mostraron que la solución de etanol tiene una mayor absortividad y un rango lineal más amplio, lo que permite determinar la concentración de la muestra con mayor precisión. La concentración encontrada de leche en polvo en la muestra fue de apro

1. USO DEL ESPECTROFOTOMETRO DE UV-VISIBLE
García Arriaga Claudia Isabel, González Paramo Julio Cesar, Guerrero.
Sánchez Patricia Fernanda, Guapo Chávez Mariana, Hernández Baena
Brandon, Tirado Vázquez Ana Gabriela.
Ingeniería Agroindustrial. Universidad Politécnica de Guanajuato. Avenida
Universidad Norte S/N, Localidad Juan Alonso Cortázar (38483),
Guanajuato, México.
RESUMEN
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite
determinar la concentración de un compuesto. Se basa en que las
moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración.
Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que
se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una
solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma.
Se pretende encontrar a la concentración real de una muestra a analizar
que es una solución de leche en polvo con ayuda de una curva de
calibración a través de espectrofotometría UV- Visible, además se hara un
barrido donde se encuentre la longitud que presenta la mayor absorbancia
además de comparar/ver la absortividad de la curva solución al 40% de
etanol vs nuestra curva de calibración que en su caso se utilizó solo agua
como solvente

2. Palabras clave: Absorbancia; transmitancia; absortividad, barrido, curva de
calibrado.
INTRODUCCION
Espectrofotometría
La espectrofotometría UV-visible
es una técnica analítica que
permite determinar la
concentración de un compuesto
en solución. Se basa en que las
moléculas absorben las
radiaciones electromagnéticas y a
su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal
de la concentración. Para hacer
este tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se
puede seleccionar la longitud de
onda de la luz que pasa por una
solución y medir la cantidad de
luz absorbida por la misma
(Nieves et al, 2010)
En espectroscopia el término luz
no sólo se aplica a la forma visible
de radiación electromagnética,
sino también a las formas UV e IR,
que son invisibles. En
espectrofotometría de
absorbancia se utilizan las
regiones del ultravioleta (UV
cercano, de 195-400 nm) y el
visible (400-780 nm).
La región UV se define como el
rango de longitudes de onda de
195 a 400 nm. Es una región de
energía muy alta. Provoca daño al
ojo humano así como quemadura
común. Los compuestos con
dobles enlaces aislados, triples
enlaces, enlaces peptídicos,
sistemas aromáticos, grupos
carbonilos y otros heteroátomos
tienen su máxima absorbancia en

3. la región UV, por lo que ésta es
muy importante para la
determinación cualitativa y
cuantitativa de compuestos
orgánicos (González, 2004).
En la región visible apreciamos el
color visible de una solución y que
corresponde a las longitudes de
onda de luz que transmite, no que
absorbe. El color que absorbe es
el complementario del color que
transmite. Por tanto, para realizar
mediciones de absorción es
necesario utilizar la longitud de
onda en la que absorbe luz la
solución coloreada (González,
2004).
Absorbancia y transmitancia
Transmitancia
La transmitancia óptica se refiere
a la cantidad de luz que atraviesa
un cuerpo, en una determinada
longitud de onda. Cuando un haz
de luz incide sobre un cuerpo
traslúcido, una parte de esa luz es
absorbida por el mismo, y otra
fracción de ese haz de luz
atravesará el cuerpo (Hernández
et al, 2002).
Absorbancia
Cuando un haz de luz incide
sobre un cuerpo traslúcido, una
parte de esta luz es absorbida por
el cuerpo, y el haz de luz restante
atraviesa dicho cuerpo. A mayor
cantidad de luz absorbida, mayor
será la absorbancia del cuerpo, y
menor cantidad de luz será
transmitida por dicho cuerpo.
Como se ve, la absorbancia y la
transmitancia son dos aspectos
del mismo fenómeno (Hernández
et al, 2002).

4. Absortividad y Absortividad
Molar
La absorbancia es directamente
proporcional a la longitud del
camino b a través de la solución y
la concentración c de la especie
absorbente. Estas relaciones se
dan como:
A = a·b·c
Siendo a una constante de
proporcionalidad llamada
absortividad. La magnitud de a
dependerá de las unidades
empleadas para b y c. A menudo b
es dada en términos de cm y c en
gramos por litro, entonces la
absortividad tiene unidades de l·g–
1·cm–1 (Brunatti). Se pretende
realizar un estudio para estimar
la concentración real de un
analito mediante
espectrofotometría Uv/Visible
utilizando 2 solventes diferentes a
través de la absortividad que estos
presenten.
MATERIALES Y METODOS
Localización: el estudio se llevó a
cabo en el laboratorio de química
y microbiología de la Universidad
Politécnica de Guanajuato, todo el
proceso se llevó a cabo alrededor
de dos días consecutivos hasta
llegar a la estandarización del
método a realizar.
Muestra
Se analizó una muestra
desconocida de leche en polvo.
Reactivos

5. Para llevar a cabo las soluciones
utilizadas en la curva de calibrado
se usó leche en polvo y como
solvente agua tridestilada; para la
solución de etanol al 40% se
utilizó alcohol etílico 96o de
pureza y agua destilada.
Instrumento
Para las medidas de la
absorbancia se utilizó un
espectrómetro de UV-Visible. Los
espectros fueron tomados
utilizando una celda de plástico de
1 cm de paso óptico. Los
espectros para el barrido y
observar la longitud de onda con
mayor absorbancia para ambas
curvas de calibrado (agua y etanol
40%) fueron medidos entre 200 y
600 nm para la selección de la
longitud de onda de trabajo
Nota: a pesar de que se hizo el
barrido y se encontrara la longitud
con mayor absorbancia se decidió
utilizar la longitud de onda de 600
nm por cuestiones de turbidez.
Estudios analíticos
Construcción de curvas de
calibración
 Solución de leche en polvo
en agua
El método de calibrado utilizado
fue el de adición estándar (a
volumen final constante). Las
curvas de calibración fueron
obtenidas usando soluciones de
leche en polvo en agua
tridestilada a diferentes
concentraciones a partir de la
solución stock donde se utilizó
0.9 gr de leche en polvo en un
matraz aforado de 100ml,
mediante dilución sucesiva, se

6. prepararon las diferentes
concentraciones (8, 7, 6, 5, 4, 3,
2, 1, 0.5, 0.2, 0.1 gr/L) cabe
mencionar que se hicieron tres
replicas para cada dilución,
Nota: las diluciones se llevaron a
cabo a partir de la ecuación
C1V1=C2V2 donde
C1 es la concentración de la
solución stock, V1 el volumen
desconocido de la solución stock
que se necesita para hacer las
diluciones, C2 la concentración de
la dilución y V2 el volumen de
25ml de un matraz aforado en
donde se prepararon las
diluciones.
 Solución de leche en polvo
en etanol al 40%
Se preparó la solución de
etanol al 40% a partir de
alcohol etílico 96o de pureza
en agua destilada.
Al igual que para la curva de
calibrado de leche en polvo en
agua se realizaron las mismas
diluciones por triplicado a partir
de la ecuación ya vista a
excepción que aquí para llegar al
aforo de 25ml se utilizó la
solución de etanol al 40% (8, 7, 6,
5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1 gr/L)
La solución stock para esta curva
se preparó con 0.9 gr de leche en
polvo en un matraz aforado de
100ml llevándolo al aforo con la
solución de etanol al 40%.
Análisis de resultados
Para encontrar la concentración
real del analito a estudiar se
construyó la curva de calibración
pertinente para ambas soluciones;
además se estudió si al usar la

7. solución de etanol como solvente
favorece o desfavorece en la
absorbancia (absortividad).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Barrido: se programó el
espectrofotómetro en una
longitud de onda de 200 a 600
nm para observar la longitud de
onda donde se muestra el pico
con mayor absorbancia
obteniéndose para la solución
leche- agua en una longitud de
onda de 305 nm y para la solución
de leche-etanol 40% en una
longitud de onda de 307.5 nm.
CONCENTRACION gr/L
ABSORBANCIA
SOL. DE AGUA SOL. ETANOL 40%
9 1.098 1.423
8 0.9863 1.2745
7 0.8856 1.182
6 0.703 0.985
5 0.5943 0.7855
4 0.483 0.61
3 0.388 0.403
2 0.2476 0.219
1 0.1073 0.1735
0.5 0.0553 0.136
0.2 0.0156 0.0975
0.1 0.00166 0.0535
Tabla 1. Absorbanciasobtenidaspara lasdos solucionesconsusrespectivasconcentraciones

8. La tabla 1 muestra el promedio de
las absorbancias de las tres
replicas obtenidas para las
diluciones de cada uno de los
solventes utilizados .
Nota: cabe mencionar que se
repitió el ensayo de la
concentración de 5gr/L de la
solución de agua ya que daba
absorbancias raras.
Para la figura 1 se decidió graficar
solamente aquellas absorbancias
que fueran menor a uno ya que
mayores a esta absorbancia se va
llegando al límite de detección y
por consecuente se va perdiendo
el rango lineal que interesa de
nuestro estudio .
Concentración muestra:
La absorbancia dada por la
muestra que se analizo fue de
0.658 en la longitud de onda de
600 nm y con ayuda de la
y = 0.1238x - 0.0078
R² = 0.9974
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ABSORBANCIA
CONCENTRACION gr/L
Figura1. Curvade calibrado para lasolución leche enpolvo-agua

9. ecuación de regresión dada por la
figura 1 que es y=0.1238x -
0.0078 despejando x la
concentración que nos da es de
5.3 gr de leche en polvo por cada
litro de agua destilada con un
99.74% de confianza.
Al igual que para la figura 1 se
decidió lo mismo para la figura 2
solamente graficar las
absorbancias menores a 1 por lo
ya antes comentado en ese
apartado.
Concentración muestra:
La absorbancia obtenida para este
análisis utilizando la solución de
etanol 40% a la misma longitud de
onda fue de 0.8640 despejando
de la ecuación dada por la figura 2
que es y=0.1516x + 0.05
despejando x como la
y = 0.1516x + 0.05
R² = 0.9971
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
0 1 2 3 4 5 6 7
ABSORBANCIA
CONCENTRACION gr/L
Figura2. Curvade calibrado para lasolución leche enpolvo-etanol40%

10. concentración es de 5.37 gr/L con un 99.7% de confianza.
La figura 3 compara la diferencia
de absortividad en el uso de
diferente disolvente a
concentraciones iguales ya que al
elegir un disolvente no solo se
tiene que tener en cuenta su
trasparencia sino también sus
posibles efectos sobre el sistema
absorbente (Skoog et al, 2001).
Además, de que la estabilidad y el
rango lineal se ven afectados por
la naturaleza del disolvente como
se muestra en la curva para la
solución leche-etanol, es
imprescindible utilizar el mismo
disolvente cuando se comparan
espectros de absorción con fines
de encontrar la concentración de
la muestra problema.
En cuanto a la absortividad
presenta mayor utilizando la
solución de etanol al 40% como
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ABSORBANCIA
CONCENTRACION gr/L
leche-agua
leche-etanol
Figura3. Comparaciónde absortividadentre lasdossolucionesutilizadascomosolvente.

11. disolvente ya que como se ha
hablado el rango lineal se ve
afectado por la naturaleza del
solvente obteniendo un rango
lineal mayor, entre los disolventes
habituales para
espectrofotometría ultravioleta se
incluyen agua, etanol del 95,
ciclohexano. Para la región visible,
cualquier disolvente incoloro es
útil (skoog et al,2001)
Estadísticamente hablando
comparando las desviaciones de
las pendientes de cada una de las
replicas hechas para cada una de
las curvas no hay diferencia
significativa dando para la curva
de la solución de etanol 40% de
0.005436 y para la solución de
agua 0.005351 unidades.
CONCLUSIONES
Logrando el objetivo se encontró
la concentración que se espera
sea la real a partir de las dos
curvas siendo prácticamente
iguales para cada una. El
disolvente etanol fue el que
presento comparado con el del
agua mayor absorbancia a la
misma concentración (debido a la
interacción del analito con el
solvente), su aplicación es que
utilizando este solvente tienes
más amplitud de conocer la
concentración desconocida o
conocer alguna otra y de tener un
mayor rango lineal.
Cabe mencionar que el solvente y
algunas condiciones de la solución
como el pH, la fuerza iónica y la

12. temperatura deben ser
optimizados y controlados para
minimizar las interferencias y
mantener la linealidad (para
prevenir la descomposición por
oxidación, fotodescomposición u
otros mecanismos). Por otro lado
se debe de mantener el equilibrio
y maximizar el tiempo de
estabilidad de la forma
absorbente.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
González, R. (2004). Curso:
Calibración de Espectrofotómetro
Ultravioleta-Visible. CASMET.
Querétaro, Qro. México.
Nieves, A. (2010).
Espectrofometría: Espectros de
absorción y cuantificación
colorimétrica de biomoléculas.
Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular. Córdoba,
España.
Hernández-Hernández, L.;
González-Pérez, C. (2002)
Introducción al análisis
instrumental. Ariel Ciencia.
Brunatti, C., Martín A. (S/A).
Introducción a la Espectroscopia
de Absorción Molecular
Ultravioleta, Visible e Infrarrojo
Cercano.
Skoog, D. A., Holler, F.J. & T. A. Ni
eman (2001) Principios de Análisis
Instrumental. 5ta Edición, Editoria
l McGraw‐Hill, México