Absorbancia

1. Absorbancia
Pedro Antonio Rodríguez Ospina
Angie Lorena Luna Mendoza
Estudiantes de Ingeniería Sanitaria
Facultad del medio ambiente y recursos naturales
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
INTRODUCCIÓN
La fracción de luz incidente absorbida por
una solución a una longitud de onda está
relacionada con el paso óptico y con la
concentración de la especie absorbente.
Estas dos relaciones están combinadas en
la ley de Lambert-Beer:
Log Io / I = ∈ c l
en donde Io e I son las intensidades de la
luz incidente y emergente
respectivamente, l el paso óptico de la
muestra absorbente (cm), c la
concentración de la especie absorbente
(moles/litro) y ∈ el coeficiente de
absorción molar (M-1 cm -1). La expresión
log Io / I se denomina absorbancia y se
designa por A (siendo adimensional).
Fijando el paso óptico (habitualmente 1
cm), resulta que la absorbancia A es
directamente proporcional a la
concentración del soluto absorbente. El
coeficiente de absorción molar varía con
la naturaleza del compuesto absorbente, el
disolvente, la longitud de onda y también
con el pH.
La aplicación obvia de la ley de Lambert-
Beer es el uso del colorímetro para
determinar la concentración de una gran
variedad de moléculas que absorben luz
(p. ej. Carotenos, clorofila, hemoglobina,
etc.). La técnica se extiende a sustancias
no coloreadas como azúcares o
aminoácidos después de alguna reacción
capaz de convertir sustancias incoloras en
derivados coloreados.
Los espectros de absorción, gráficos que
relacionan absorbancia con longitudes de
onda, son frecuentemente utilizados en
Bioquímica para la caracterización e
identificación de biomoléculas.
En esta práctica se realizará un sencillo
análisis espectrofotométrico consistente
en la obtención del espectro de absorción
y construcción de una curva patrón para
verificar la ley de Lambert-Beer, calcular
el coeficiente ∈ y determinar la
concentración de una muestra .
RESUMEN
La espectrofotometría UV-visible es una
técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en
solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de
forma lineal de la concentración. Para
hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotómetro, en el que se puede
seleccionar la longitud de onda de la luz
que pasa por una solución y medir la
cantidad de luz absorbida por la misma.
En esta práctica se darán a conocer las
características generales y conceptos

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relacionados con la espectrofotometría. A
continuación y tras la explicación del
funcionamiento del espectrofotómetro se
harán espectros de absorción con el fin de
determinar la longitud de onda donde la
muestra presenta la máxima absorción, y
tras realizar las correspondientes rectas de
calibrado se cuantificarán las
concentraciones de distintas
biomoléculas.
OBJETIVOS
Determinar la concentración de una
solución por espectrofotometría.
Establecer una relación entre la
absorbancia y la concentración de una
solución (Curva de calibración).
MARCO TEÓRICO
Un espectrofotómetro o colorímetro hace
uso de la transmisión de la luz a través de
una solución para determinar la
concentración de un soluto dentro de la
solución. Un espectrofotómetro difiere de
un colorímetro en la manera en la cual la
luz es separada en sus longitudes de onda
componentes. Un espectrofotómetro usa
un prisma y un colorímetro utiliza filtros.
Ambos se basan en un diseño simple en el
cual la luz de una determinada longitud
de onda pasa a través de una muestra y se
mide la cantidad de luz que es
transmitida. Esto es realizado colocando
una fotocelda del otro lado de la muestra.
Todas las moléculas absorben energía
radiante en una longitud de onda u otra.
Esas que absorben energía dentro del
espectro visible son conocidos como
pigmentos. Las proteínas y los ácidos
nucleicos absorben luz en el rango
ultravioleta.
La absorbancia: Es el negativo del
logaritmo en base 10 de la transmitancia.
A = - log10 T
A=absorbancia
T=transmitancia
La absorbancia es más útil en
espectrofotometría que la transmitancia,
debido a que la representación gráfica de
la concentración versus la absorbancia
produce una línea recta.
La representación gráfica de la
concentración versus la transmitancia es
exponencial. El -log calcula el inverso de
la transmitancia, de tal manera que
laabsorbancia aumenta con la
concentración creciente de colorante.
La relación de la absorbancia con la
concentración se encontró por dos
bioquímicos que tiene la ecuación para

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una línea recta, y= mx +b, dónde la m es
la pendiente de la línea y b es la
intercepción de la recta con el eje y. Si la
medición se realiza de tal manera que b =
0 (es decir, una solución que no contiene
colorante no tiene absorbancia), y si
substituimos a absorbancia por y,
entonces la concentración por x, m,
llegamos a la formulación de la Ley de
Beer-Lambert:
A = ε Cl
Donde A = absorbancia
C = concentración molar
ε = el coeficiente de extinción molar para
una determinada longitud de onda
l = distancia que atraviesa la luz por la
muestra en centímetros.
Después de registrar la absorbancia para
una serie de muestras de concentración
conocida (estándares), se hace una gráfica
del valor de absorbancia (el eje vertical o
Y)vs la concentración (el eje de las
abscisas o X). La pendiente de la línea es
el coeficientede extinción (ε).
Espectro de absorbancia
El análisis de pigmentos a menudo
precisa un uso diferente de un
espectrofotómetro. En la utilización del
instrumento para la determinación de la
concentración de una sustancia(las Leyes
de Beer-Lambert), la longitud de onda fue
determinada y colocada en un valor a
todo lo largo del procedimiento. Este
valor es determinado por un análisisde la
absorción de una solución variando la
longitud de onda. Independientemente del
equipo utilizado, la línea de base debe ser
continuamente fijada cada vez que la
longitud de onda sea variada.
Al utilizar un espectrofotómetro con un
solo portaceldas, el equipo es colocado
en0A/100%T con el “blanco”, la longitud
de onda es colocada y luego la muestra es
colocada y leída. La longitud de onda es
variada por arriba o por abajo, el equipo
es colocado en 0A/100%T con el
“blanco”, se coloca la misma muestra y es
leída. Este procedimiento se repite con
todos los valores de longitud de onda que
vayan a ser utilizados.
En este procedimiento, la muestra es la
misma, pero la longitud de onda es
variada. Los compuestos tienen diferentes
coeficientes de absorción para cada
longitud de onda. Así, cada vez que la
longitud de onda es alterada, el
instrumento debe ser recalibrado.

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MATERIALES Y REACTIVOS
Balon aforado de 25 ml
vidrio de reloj
Pipeta graduada de 10 ml
Beacker de 50 ml
Agitador de vidrio
Tubos de ensayo (8)
Gradilla
Agua destilada
Muestras
Equipos
Balanza , Espectrofotómetro
RESULTADOS
Tabla 1. Índice de absorbancia y
concentración del sulfato de cobre a
partir del volumen de dilución.
Solución
de Sulfato
de cobre
(ml)
Concentración
(M)
Absorbancia
21 0.002 0.050
3 0.006 0.159
5 0.01 0.295
6 0.012 0.345
7 0.014 0.406
Imagen 1. Índice de absorbancia
Fuente: Propia-Tomada por Angie Luna.
Fecha: 27/09/15
Imagen 2.Preparación de la muestra en
blanco.
Fuente: Propia-Tomada por Angie Luna.
Fecha: 27/09/15

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Grafico 1 .Curva de calibración
Los datos graficados en la curva de
calibración, son datos obtenidos luego de
unos cálculos previamente realizados.
Para mayor claridad y veracidad de los
mismos, se anexan cada uno de los
cálculos empleados.
ANALISIS DE RESULTADOS
La Tabla N° 1 muestra la absorbancia
calculada para cada una de las soluciones
patrón, éstos valores son los empleados
para la construcción de la curva de
calibración .
Al realizar la curva de calibración para
los valores de absorbancia con respecto a
los de concentración de los patrones
(tabla N° 1), se puede apreciar que varía
linealmente en función de la
concentración de sulfato, tal como se
esperaba. Aún cuando la tendencia no es
exactamente una recta si se aproxima
bastante a dicha forma y las desviaciones
de la linealidad se pueden deber a errores
en la preparación de las soluciones
patrón, donde éstos afectan directamente
la concentración de las muestras,
afectando de manera significativa las
tendencia de la curva de calibración, lo
cual influyó en los valores obtenidos de
absorbancia y por ende no se obtuvo
perfectamente una recta. La grafica N° 1
es la representación gráfica de la curva de
calibración del equipo utilizado.
CONCLUSIONES
La absorbancia de longitud de onda es
una propiedad física que nos permite
identificar semejanzas entre ciertos
compuestos. Esta característica física
depende de las concentraciones de las
soluciones. En esta práctica, la
absorbancia de longitud de onda se debía
a la diferente concentración de una misma
solución. En biotecnología, microbiología
y bioquímica, este principio se puede
utilizar para la cuantificación de
sustancias y microorganismos. La
absorbancia de longitud de onda arroja
información sobre la naturaleza de la
sustancia e indica qué cantidad de la
sustancia está presente en la muestra en
cuestión.
y = 29.469x - 0.0588
R² = 0.9979
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.02 0.04 0.06 0.08
Curva de Calibración
Absorbancia
Concetración

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BIBLIOGRAFÍA
● Harris, D. C. Análisis Químico
Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed.
Reverté, 2007.
● Higson, S. P. J. Química Analítica. 1ª
ed. Capítulo 5. Ed. Mc Graw Hill. 2007.
● Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.;
De La Fuente García-Soto, M.M.; Pozas
Requejo, F.; Díaz Lorente, V.M.
Experimentación en Química General.
Capítulo 5.
Ed. Thomson Paraninfo, 2006.
● Hernández-Hernández, L.; González-
Pérez, C. Introducción al análisis
instrumental.
Capítulo 3. Ed. Ariel Ciencia, 2002.