Este informe resume los resultados de un taller de espectrofotometría. En la primera parte, se realizaron diversos controles espectrofotométricos como luz espuria, volumen mínimo, cubetas, centro de banda y linealidad, los cuales aprobaron satisfactoriamente. En la segunda parte, se determinó la concentración de colágeno hidrolizado en muestras mediante la técnica de Biuret, obteniéndose concentraciones de 12,3 y 54 mg/L.

1. Informe Taller de Espectrofotometría
Objetivos:
● Analizar y realizar distintos controles espectrofotométricos (luz espuria, volumen
mínimo, cubetas, linealidad fotométrica).
● Determinar la longitud de onda óptima de trabajo correspondiente a una solución
coloreada de un analito mediante un barrido espectral.
● Determinar la concentración de colágeno hidrolizado en una muestra mediante el
uso de la técnica Biuret con espectrofotometría para determinación de proteínas.
Materiales y métodos:
Según guía de actividades: Espectrofotometría ; Cátedra física; Facultad de Farmacia y
Bioquímica, segundo cuatrimestre de 2018.
Resultados
Parte 1:
a) Control de la luz espuria:
Tabla 1. Datos de transmitancia a λ de 500 nm
Transmitancia (%)
Cubeta con agua 100,0
Cubeta de obstrucción 0,0
➔ Se considera aceptable el porcentaje de luz espuria puesto que no excede el 1%,
teniendo en cuenta que el valor de %T de la cubeta de obstrucción es equivalente al
valor medido.
b) Control del volumen mínimo:
Tabla 2. Datos del control de volumen mínimo

2. Volumen de Solución de
trabajo (mL)
Absorbancia
(a λ =558 nm)
0,5 0,079
0,7 0,079
1,0 0,144
1,2 0,242
1,4 0,346
1,6 0,365
1,7 0,366
1,8 0,359
1,9 0,358
2,0 0,357
2,1 0,356
2,2 0,357
2,3 0,355
2,4 0,356
2,5 0,358
3,0 0,359
3,4 0,359

3. Figura 1. Absorbancia en función del volumen de solución cargado en la cubeta.
➔ Volumen mínimo: 3,0 mL
➔ Volumen de trabajo (Vmín +20%): 3,6 mL
c) Control de cubetas:
Tabla 3. Datos de las cubetas evaluadas
Cubetas Transmitancia
(%)
1 45,2
2 43,5

4. 3 45,0
➔ Se seleccionaron las cubetas 1 y 3 dado que la diferencia entre sus transmitancias
no excede el 1%, mientras que la cubeta 2 dista significativamente de estas dos.
d) Control de centro de bandas:
Tabla 4. Absorbancia obtenida para soluciones de referencia de distintos colorantes.

5. Figura 2. Barrido espectral de distintos colorantes.
Tabla 5. Valores de referencia de la longitud de onda de máxima absorbancia.

6. e) Control de la linealidad fotométrica:
Tabla 6. Datos del barrido espectral de la solución de trabajo.
Longitud de onda
(nm)
Absorbancia
520 0,590
525 0,647
530 0,698
535 0,757
540 0,810
545 0,868
550 0,906
555 0,913
560 0,885
565 0,825
570 0,723
575 0,589
580 0,442

7. 585 0,302
590 0,202
595 0,140
600 0,093
Figura 3. Barrido espectral de la solución de trabajo.
➔ Longitud de onda óptima de trabajo: 555 nm
Tabla 7. Datos de la absorbancia (λ=555nm) de soluciones de concentraciones crecientes.

8. Concentración de la solución
(% V/V)
Absorbancia
(a λ = 555 nm)
0,0 0,000
12,5 0,156
12,5 0,157
25,0 0,280
25,0 0,282
50,0 0,498
50,0 0,496
75,0 0,696
75,0 0,694
100,0 0,923
100,0 0,922
Figura 4. Absorbancia (λ=555nm) en función de la concentración de la solución de trabajo.

9. ➔ Relación entre las variables: Tendencia lineal.
➔ R2
: 0,997
➔ Rango de linealidad fotométrica (Abs): 0,000-0,923
f) Control de la veracidad:
Tabla 8. Datos de absorbancia de una solución de referencia de cloruro de cobalto
determinada a λ=512 nm.

10. Tabla 9. Estimación de la veracidad fotométrica a través del cálculo del error fotométrico.
Se considera aceptable un EF% entre ±5%
g) Control de la precisión:
Tabla 10. Control de la precisión fotométrica.
Se considera aceptable un valor de CV% menor al 1%
Tabla 11. Resumen de los controles espectrofotométricos realizados al equipo 6.
Control
espectrofotométrico
Aprobación Información

11. Luz espuria accidental Si % luz espuria 0,0
Cubetas Si --------------------- -------
Volumen mínimo Si Volumen de trabajo (mL) 3,6
Centro de banda Si Colorante / λ de máxima Abs Rojo Congo / 495 nm
Linealidad fotométrica Si Rango de linealidad (Abs) 0,000-0,923
Veracidad Si EF (%) 3
Precisión Si CV (%) 0,3
Parte 2:
Imagen 1. Observación de la coloración púrpura del producto de reacción con reactivo
Biuret.
➔ Los tubos de la izquierda corresponden a los tubos 1, 3, 5 y 7 que contienen los
testigos de colágeno hidrolizado + Reactivo de Biuret.
➔ El tubo de la derecha corresponde al tubo 9 (testigo de reactivo de Biuret).

12. Tabla 12. Datos del barrido espectral de la reacción Biuret (Equipo Nº 6)
Figura 5. Barrido espectral de la reacción con Biuret (Equipo Nº 6)
➔ Longitud de onda óptima de trabajo: λ= 543 nm
Tabla 13. Datos para la determinación de la concentración de colágeno hidrolizado.

13. Tub
o
Testigo 1
20 mg/mL
(mL)
Testigo 2
40 mg/mL
(mL)
Testigo 3
60 mg/mL
(mL)
Testigo 4
80 mg/mL
(mL)
Agua
destilad
a (mL)
Muestra
1 (mL)
Muestra
2 (mL)
Reactiv
o Biuret
(mL)
Absorbancia
a λ=543 nm
1 0,2 4,0
0,210
2 0,2 4,0
0,005
3 0,2 4,0
0,427
4 0,2 4,0
0,000
5 0,2 4,0
0,570
6 0,2 4,0
0,002
7 0,2 4,0
0,680
8 0,2 4,0
0,000
9 0,2 4,0
0,058
10 0,2 4,0
0,154
11 0,2 4,0
0,175
12 4,0 0,2
0,000
13 0,2 4,0
0,505
14 0,2 4,0
0,492
15 4,0 0,2
0,000
➔ Los tubos 1, 3, 5 y 7 contienen los testigos 1, 2, 3 y 4 respectivamente junto con el
reactivo de Biuret, por lo que las absorbancias correspondientes a ellos indican la
absorbancia de todas las sustancias contenidas en la muestra.
➔ Los tubos 2, 4, 6 y 8 corresponden a los blancos de testigos 1, 2, 3 y 4
respectivamente y su absorbancia permiten corregir la absorbancia de los testigos.

14. ➔ Los tubos 10 y 11 corresponden a las absorbancias para la muestra 1 y los tubos 13
y 14 son las de la muestra 2.
➔ Los tubos 12 y 15 son los blancos de muestra 1 y 2 respectivamente.
➔ El tubo 9 corresponde al blanco de reactivo, puesto que contiene al reactivo de
Biuret solamente y permite determinar su absorbancia en ausencia del reactivo.
➔ El blanco de solvente (agua) no se encuentra reportado en la tabla, pero se empleó
para calibrar (llevar a Abs = 0,000) el espectrofotómetro a la longitud de onda óptima
de trabajo (λ= 543 nm).
Tabla 14. Valores corregidos de las absorbancias a 543 nm de las soluciones testigos
empleadas en la determinación de la concentración de colágeno hidrolizado.
concentración
(mg/mL)
Absorbancia corregida
Agua 0,0 0,000
Testigo 1 20,0 0,147
Testigo 2 40,0 0,369
Testigo 3 60,0 0,510
Testigo 4 80,0 0,622
Muestra 1 11,0 0,096
Muestra 1 13,6 0,117
Muestra 2 54,9 0,447
Muestra 2 53,2 0,434
Tabla 15. Concentraciones de las muestras incógnitas

15. Abs promedio corregida Concentración de colágeno hidrolizado
(mg/L)
Muestra 1
0,107 12,3
Muestra 2
0,441 54,0
Figura 6. Absorbancia a 543 nm en función de la concentración de colágeno hidrolizado de
los testigos procesados.
➔ Relación entre las variables: tendencia lineal
➔ Ecuación de la recta: y = 0,003 x + 0,0082
➔ R2: 0,9873
Discusión
Parte 1:

16. En la primera parte del presente taller se llevaron a cabo distintos controles
espectrofotométricos con la finalidad de corroborar el funcionamiento adecuado del equipo
Nº6, a continuación se procederá a discutir los resultados obtenidos para cada uno de
dichos controles:
Control de la luz espuria accidental:
Este control tiene como objetivo comprobar que toda la luz que llega al detector haya
atravesado e interactuado con la muestra. Los datos obtenidos se representaron en la tabla
1. Se realizó la calibración a �= 500 nm (aunque puede emplearse cualquier longitud de
onda) del espectrofotómetro con una cubeta normal de características conocidas que
contenía agua y se llevó a transmitancia del 100%, ya que el agua, al no absorber ninguna
longitud de onda, debe dejar pasar a través de ella toda la luz que se le incide, y por lo tanto
se transmite la totalidad de la luz. Seguidamente se realizó la medición de la transmitancia
colocando una cubeta de obstrucción y se esperaba que, dado que esta es completamente
negra, absorbiera la totalidad de la luz que emite la fuente de luz del equipo y en
consecuencia la transmitancia detectada fuera del 0%. El resultado experimental para este
control resultó ser una transmitancia del 0,0 % la cual concuerda con lo esperado y además
cumple con el valor aceptable de la luz espuria que es de hasta un 1% máximo.
Se debe tener en cuenta que el valor de la transmitancia leída se considera directamente
como el porcentaje de la luz espuria puesto que como se mencionó con anterioridad al
colocar una cubeta de obstrucción se espera si toda la luz interacciona con dicha cubeta la
transmitancia sea de cero, por tanto si dicha transmitancia representa un valor mayor a cero
implica que parte de la luz incidida no está interactuando con la cubeta de obstrucción y
está siendo captada por el detector.
Control del volumen mínimo:
El presente control tiene como objetivo determinar el volumen mínimo de muestra que se
debe depositar en la cubeta para que todo el haz de luz interaccione con ella, de forma de
que no pase por arriba del menisco y actúe como luz espuria (implicando valores menores
de absorbancia o mayores de transmitancia en las mediciones experimentales). Los
resultados obtenidos se encuentran representados en la tabla 2 y corresponden a los
valores medidos de absorbancia de volúmenes crecientes de solución coloreada de trabajo
(�=558 nm). Con dichos datos se elaboró un gráfico (figura 1) que relaciona la absorbancia
(lectura del equipo) en función del volumen agregado de solución de trabajo en la cubeta.
Tomando en cuenta la figura 1, se tiene que a partir del agregado de 3,0 mL de solución de
trabajo se obtuvieron valores de absorbancia constantes, lo cual implica que se estabilizó la
lectura del instrumento y por tanto dicho volumen representa el volumen mínimo requerido
para que el instrumento pueda detectar adecuadamente la absorbancia/transmitancia de la
solución coloreada a analizar. Por otra parte, se debe tener en cuenta que se consideró
como volumen óptimo de trabajo = volumen mínimo + 20%, lo cual corresponde a un
volumen de 3,6 mL. Finalmente se debe destacar que este control además de ser de gran
importancia para determinar el volumen a partir del cual el espectrofotómetro tiene la
capacidad de medir valores estables, también sirve para ahorrar muestra empleada ya que
utilizando el mínimo volumen indispensable se evita el desperdicio de reactivos.

17. Control de cubetas:
En este control se busca comparar la similitud de las propiedades ópticas de distintas
cubetas con la finalidad de seleccionar varias con cualidades similares y de esta forma
mejorar el proceso de medición sin que los resultados y las mediciones no se vean
afectadas por el uso de distintas cubetas de medición. Los resultados obtenidos se
encuentran representados en la tabla 3 y el control se realizó tomando como criterio de
comparación la medición de la transmitancia de una solución coloreada de trabajo a �=558
nm. Se obtuvo entonces que las cubetas 1 y 3 podrían ser usadas en conjunto puesto los
valores de transmitancia medidos con ellas no distan entre sí más de un 1%, teniéndose
una transmitancia de 45,2% para la cubeta 1 y de 45,0% para la cubeta 3. Por otra parte la
solución medida en cubeta 2 presentó una transmitancia del 43,5%, y al distar más de 1%
de las otras dos cubetas analizadas se tiene que esta no cumple con el criterio de
aprobación del control y por lo tanto no debe emplearse en las mediciones en conjunto con
las cubetas 1 y 3, puesto que, al diferir con las propiedades ópticas de estas, su uso influiría
significativamente en los valores medidos.
Control de centro de banda:
Los resultados que se muestran en la tabla 4 fueron extraídos de la carta de control del
equipo, seleccionado como colorante de referencia el colorante Rojo Congo del cual se
conoce que presenta su máxima absorción a una longitud de onda de �= 498 ± 1 nm (Tabla
5). Se tiene que para dicho colorante se obtuvo el máximo de absorción a una longitud de
onda de 495 nm, esto se pudo evidenciar en la figura 2 donde se representa el barrido
espectral medido con el equipo N°6 para distintos colorantes. Teniendo en cuenta el valor
de longitud de onda de máxima absorción obtenida para el rojo Congo, se observa que el
equipo 6 presenta un corrimiento de centro de banda de ±3 nm, el cual se encuentra dentro
de los valores aceptables para la aprobación del control y se puede considerar como un
error de tipo sistemático el cual puede ser corregido. Finalmente se debe tener en cuenta
que el presente control permite verificar que la longitud de onda fijada con el selector del
equipo sea corresponde con la longitud de onda del haz de luz que interactúa con la
muestra, por lo que en este control se está evaluando el correcto funcionamiento del
sistema de monocromación del equipo y el selector de �.
Control de la linealidad fotométrica:
El presente control permite verificar que el equipo tenga una respuesta lineal en relación
con la absorbancia de las soluciones coloreadas medidas y la concentración de las mismas,
y además se busca evaluar el rango de absorbancias para el cual el equipo tiene la
capacidad de mantener dicha respuesta lineal. Para realizar el control se empleó una
solución coloreada de una sustancia de referencia de rojo fenol básico (�=558 nm) de la
que se tiene conocimiento que cumple con la ley de Lambert-Beer. Seguidamente se realizó
un barrido espectral de la misma con la finalidad de seleccionar la longitud óptima de
trabajo. Los datos obtenidos para dicho barrido espectral se encuentran representados en la
tabla 6 y a partir de ellos se elaboró un gráfico (figura 3) en el que se representa la
absorbancia de la solución de referencia en función de la longitud de onda en un rango de
520 nm a 600 nm.

18. Tomando en cuenta la figura 3 se determinó que la longitud de onda óptima de trabajo
corresponde a �=555nm puesto que se obtuvo un máximo de absorbancia a dicha longitud
de onda y además no se presenta un cambio drástico en los valores de absorbancia
obtenidos a las longitudes de ondas cercanas (mayores o menores). Continuando se tiene
que se elaboraron diluciones de la solución de referencia y se midieron sus respectivas
absorbancias a la longitud de onda óptima seleccionada previamente, los datos obtenidos
de estas mediciones se encuentran reportados en la tabla 7.
A partir de los datos de absorbancia mencionados anteriormente se elaboró un gráfico
(figura 4) de absorbancia a λ=555nm en función de la concentración de la solución
coloreada de referencia. Resulta notable el hecho de que existe una tendencia lineal entre
dichas variables y además se verificó que la correlación entre ellas es bastante marcada
puesto que se obtuvo un R2
de 0,997. De esta forma se comprobó que el espectrofotómetro
(Equipo Nº6) responde linealmente en un rango de absorbancias de 0,000 a 0,997. Se debe
tener en cuenta que, aunque la solución coloreada en estudio cumpla con la ley de Lambert-
Beer, el rango de linealidad corresponde a la capacidad que tiene el instrumento para
realizar la medición de la absorbancia adecuadamente y no implica que la sustancia deje de
cumplir con la ley de Lambert-Beer, sino que es una limitación experimental que presentan
dichos equipos, ya que cuando se tienen altas absorbancias es más difícil que el detector
discrimine la cantidad de luz llegue puesto que se tratan de cantidades minúsculas.
Control de la veracidad:
El presente control permite analizar la veracidad del método espectrofotométrico. Los datos
recuperados de la carta de control del equipo Nº6 se encuentran en la tabla 8 que
corresponden a los datos de las 10 mediciones de absorbancia de una solución de cloruro
de cobalto cuya longitud de onda óptima es de λ=512 nm, y en la tabla 9 se encuentran los
resultados de la evaluación de la veracidad fotométrica. Se obtuvo un error fotométrico (ver
anexo de cálculos) del ±3% el cual se considera aceptable puesto que es menor al valor
máximo aceptado (±5%) para dicho error. Se debe tener en cuenta que para realizar este
control es necesario contar con un valor de referencia de la absorbancia de la sustancia de
trabajo seleccionada, obtenido de la literatura, o medido mediante otro espectrofotómetro
que se encuentre correctamente calibrado y con los controles fotométricos aprobados.
Control de la precisión fotométrica:
El presente control tiene como objetivo la evaluación de la reproducibilidad de las
mediciones de absorbancia realizadas con una misma solución de referencia de cloruro de
cobalto. La serie de mediciones se encuentra reportada en la tabla 8 y, al igual que para el
control anterior, los datos fueron recuperados de la carta de controles del equipo Nº6 y los
resultados del control de precisión se encuentran en la tabla 10. Se debe tener en cuenta
que, partiendo de la serie de datos, se realizó un procesamiento estadístico de los mismos y
se determinó su coeficiente de variación (ver anexo de cálculos) el cual dio un valor de
0,3%. Esto se considera como un valor aceptable puesto que es menor al 1% de variación.
Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado se puede afirmar que equipo Nº6 aprobó el
control de precisión fotométrica y por lo tanto las medidas de absorbancias realizadas con
este son reproducibles y por tanto el método de medición se puede considerar preciso.

19. Resultados de los controles fotométricos:
En la tabla 11 se encuentran reportados los resultados de todos los controles fotométricos
realizados al equipo Nº6 y se puede concluir a partir de ellos que el equipo se encuentra en
correcto funcionamiento, puesto que se aprobaron todos los controles evaluados. Por lo
tanto se puede asegurar que el equipo se encuentra funcionando adecuadamente y que los
valores de las medidas realizados empleando dicho espectrofotómetro son confiables,
siempre y cuando se trabaje en las condiciones óptimas de trabajo y respetando su rango
de linealidad fotométrica.
Parte 2:
En la segunda parte del presente taller se buscaba determinar cuantitativamente la
concentración de colágeno hidrolizado (proteínas) en dos soluciones muestras, empleando
el reactivo de Biuret como técnica espectrofotométrica. Cabe destacar que la
espectrofotometría consiste en una técnica analítica que tiene como fundamento la
espectroscopía de absorción molecular. Además se debe tener en cuenta que mediante la
ley de Lambert-Beer se puede relacionar directamente la absorbancia de cierta solución
coloreada con la concentración de la misma, puesto que estas dos variables son
directamente proporcionales entre sí tal y como se plantea a continuación:
Continuando, se tiene que, utilizando el método de Biuret bajo condiciones alcalinas, las
sustancias que contengan una o más uniones peptídicas forman un complejo coloreado
púrpura con las sales de cobre presentes en dicho reactivo, como se observa a la izquierda
de la imagen 1. Por otra parte las sustancias que no contienen uniones peptídicas
reaccionan dando una coloración celeste como se observa a la derecha de la imagen.
Teniendo en cuenta lo anteriormente planteado, podemos decir que el uso de la reacción
con el reactivo de Biuret es un método adecuado para la cuantificación de la concentración
de colágeno hidrolizado, ya que se trata de una proteína y por lo tanto posee uniones
peptídicas. El uso del reactivo de Biuret es de gran importancia puesto que de esta forma se
obtienen sustancias coloreadas cuya intensidad de coloración es proporcional a la cantidad
de proteína, y de esta forma se puede emplear la espectrofotometría como técnica analítica.
En cuanto a la determinación de la longitud de onda óptima de trabajo, se recuperó de las
cartas de control del equipo Nº6 un barrido espectral de la reacción de Biuret cuyos datos
están reportados en la tabla 12, a partir de los cuales se elaboró el gráfico 5 en el cual se
representa la absorbancia de la reacción Biuret en función de la longitud de onda.
Observando el barrido espectral obtenido, se hace notable que la longitud de onda óptima
para dicha reacción es la correspondiente a λ=543 nm puesto que se encuentra entre las
dos longitudes en las que se dieron las dos mediciones de absorbancia máxima (540 nm y
545 nm). Se estima también que al no presentar cambios drásticos en los valores de
absorbancia cercanos se evitan errores causados por el ancho de banda y además se
asegura que al usar una longitud de onda a la cual la solución a analizar presente una
buena absorbancia se mejora la sensibilidad de la medición.

20. Continuando, en la tabla 13 se encuentran representados los datos del contenido de los
tubos preparados para llevar a cabo el protocolo para la cuantificación de la concentración
de colágeno hidrolizado en dos muestras incógnitas. Se tiene entonces que para la
elaboración de una curva de calibración de absorbancia en función de la concentración de
colágeno hidrolizado se prepararon una serie de tubos que contenían testigos de colágeno
hidrolizado de concentraciones crecientes, a las cuales se les realizó la medición de la
absorbancia luego de su reacción con el reactivo de Biuret. Se debe tener en cuenta que
fue necesario corregir dichos valores de absorbancias medidos y para ello se les restó a
dichos valores las absorbancias obtenidas para los blancos de testigos que consistían
solamente del testigo disuelto en agua. Por último también se le restó el valor de
absorbancia correspondiente al blanco de reactivo (agua + reactivo Biuret)
Además se debe tener en cuenta que se prepararon por triplicado los tubos de muestras 1 y
2 que contienen los analitos y cuyas concentraciones se desea determinar. Esto se debe a
que posteriormente se debe hacer la corrección de las absorbancias medidas restándole a
esta la absorbancia de los tubos blancos de muestra y la absorbancia del tubo blanco del
reactivo. De acuerdo a lo planteado con anterioridad se hace necesario mencionar que el
tubo blanco de muestra permite medir la posible absorbancia de impurezas, es decir
compuestos presentes en la muestra que no constituye parte del analito (colágeno
hidrolizado). De esta forma al restar la absorbancia de este tubo blanco de muestra se evita
que se incluyan dichos compuestos como parte de la ‘’cantidad de colágeno’’ y por tanto se
obtenga un valor de concentración de colágeno mayor al que se encuentra realmente en la
muestra.
También es importante realizar la corrección de la absorbancia restando el tubo blanco de
reactivo ya que con esto se elimina la absorbancia propia que presenta el reactivo de Biuret
aún en ausencia del analito y que por lo tanto si no se corrige puede ocasionar que se
determine una concentración de analito mayor a la presente en las muestras debido a que
la absorbancia medida incluye a la propia del reactivo. Finalmente se tiene el tubo blanco de
solvente que en el caso del presente protocolo es agua y permite realizar la calibración del
equipo (llevar a 0 su absorbancia).
En concordancia con lo planteado anteriormente se realizó la corrección de los valores de
absorbancia para los testigos de colágeno hidrolizado y las muestras incógnitas y los
resultados obtenidos se plasmaron en la tabla 14, a partir de la cual se elaboró la curva de
calibración (figura 6) de absorbancia a 543 nm en función de la concentración de colágeno
hidrolizado, observando dicho gráfico se hace evidente que existe una marcada tendencia
lineal entre dichas variables y se tiene para la recta obtenida un R2
de 0,9873 el cual
permite corroborar la correlación entre la concentración de colágeno y la absorbancia de la
solución. Finalmente se tiene que empleando la ecuación de la recta obtenida, se interpoló
el promedio de las absorbancias obtenidas (tabla 15) para la muestra 1 y la muestra 2 y de
esta forma se determinó que la concentración de colágeno hidrolizado presente en las
mismas son de 12,3 mg/mL y 54,0 mg/mL respectivamente.
Conclusiones

21. ● Se llevaron a cabo distintos controles espectrofotométricos (luz espuria, volumen
mínimo, cubetas, linealidad fotométrica) y se estudió la importancia de los mismos
con la finalidad de verificar el correcto funcionamiento del espectrofotómetro y las
condiciones óptimas de trabajo para optimizar la calidad de las mediciones
realizadas. Luego de realizar todos los controles enunciados, se puede concluir que
el equipo Nº6 se encuentra en cumplimento de los controles fotométricos y por lo
tanto se puede asegurar que su funcionamiento es el adecuado.
● A partir de la elaboración de barridos espectrales se determinó que la longitud de
onda óptima para la medición de absorbancia de la solución de trabajo del control de
la linealidad es de 555 nm mientras que la de la reacción de Biuret está dada por
una longitud de onda de 543 nm.
● Se determinó mediante espectrofotometría aplicando el método de Biuret que la
concentración de colágeno hidrolizado en la muestra 1 es 12,3 mg/L y para la
muestra 2 es de 54,0 mg/L. Por lo tanto se puede concluir que la espectrofotometría
constituye una técnica análitica útil en la determinación cuantitativa de la
concentración de analitos en soluciones coloreadas tomando como fundamento la
ley de Lambert-Beer.
Anexo de cálculos
*Cálculo del volumen óptimo de trabajo:
*Cálculo del error fotométrico (%):
*Cálculo del coeficiente de variación porcentual (CV %):

22. *Corrección de los valores de absorbancia medidos experimentalmente:
Abs corregida
Abs Abs - Blanco Biuret Abs - Blanco testigo
Testigo 1 0,210 0,152 0,147
Testigo 2 0,427 0,369 0,369
Testigo 3 0,570 0,512 0,510
Testigo 4 0,680 0,622 0,622
Muestra 1 0,154 0,096 0,096
Muestra 1 ' 0,175 0,117 0,117
Muestra 2 0,505 0,447 0,447
Muestra 2` ‘ 0,492 0,434 0,434
➔ Testigo 1, Testigo 2, Testigo 3 y Testigo 4 corresponden a los valores de
absorbancia medidos para los tubos 1, 3, 5 y 7 respectivamente.
➔ Muestra 1, 1’, 2 y 2’ corresponden a los valores de absorbancia medidos para los
tubos 10, 11, 13 y 14 respectivamente.
➔ El blanco de Biuret corresponde al valor de absorbancia medido para el tubo 9.
➔ Los blancos testigos corresponden a los tubos 2, 4, 6 y 8 para los testigos 1, 2, 3 y 4.
Con respecto a las muestras, para la muestra 1 corresponde el tubo 12 mientras que
para la muestra 2 corresponde el tubo 15.
➔ Los datos fueron procesados en Excel para realizar las correcciones planteadas en
la tabla con el fin de determinar el valor de absorbancia relacionado con la
concentración de colágeno hidrolizado presente en cada uno de los tubos.
*Cálculo de la concentración:
Se empleó la ecuación de la recta obtenida en la figura 6 para interpolar los valores de
absorbancias medidos de las muestras incógnitas y de esa forma determinar la
concentración de cada una de ellas.