1. -478663-6413503220913-942975<br />FACULTAD DE INGENIERÍA, ARQUITECTURA Y URBANISMO<br />ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Y COMERCIO EXTERIOR<br />CONTROL DE CALIDAD DE LECHE<br />AREA: microbiología aplicada <br />DOCENTE: Patricia Fernández Pérez<br />CICLO: III<br />INTEGRANTES: <br /> <br />LEONARDO LÓPEZ WILSON<br />VILLEGAS CAMPOS ROSINALDO<br />CHERO ARROYO ALAN<br />CHAMBERGO ALVA KATHERINE LIZZETH<br />Pimentel 7 de abril del 2010<br />PRACTICA N° 4<br />PRUEBA DE REDUCCIÓN DE COLORANTE PARA LECHES FRESCAS (TRAM)<br />I. INTRODUCCIÓN<br />La complejidad bioquímica de la leche en su composición y su elevada actividad de agua la convierte en una de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente la mayor parte de los microorganismos y bien se podría catalogar como un medio universal de cultivo.<br />Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos patógenos o de sus toxinas y el segundo a las características de conservación de la misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor número de flora saprofitita, esta en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminución de las propiedades nutritivas y organolépticas del producto.<br />Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la Industria Láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de la aplicación de las buenas prácticas higiénicas.<br />M.O indicadores:<br />Bacterias aeróbicas Mesófilas<br />Coliformes totales y fecales<br />Enterobacterias totales<br />Enterococos<br />El desarrollo de métodos rápidos y/o automatizados en el diagnostico de la calidad higiénico sanitaria de la leche y sus productos constituye en los últimos años una necesidad enfocada en lo fundamental en la obtención de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea liberado en el mercado.<br />Estos métodos rápidos de diagnóstico bacteriológico en leche se han clasificado atendiendo a diferentes puntos de vistas, no obstante, en lo fundamental han tomado como base los aspectos siguientes: Rapidez con que se obtienen las respuestas, la actividad metabólica de los microorganismos, posibilidades de automatización y principios de medición en que se basan las lecturas.<br />Teniendo en cuenta la diversidad de estas clasificaciones y para una mayor inclusión de métodos rápidos empleados en el diagnóstico microbiológico de la leche, están agrupados en tres grupos: métodos directos, indirectos y en métodos para diagnóstico de microorganismos específicos.<br />El método usado en esta práctica es un método indirecto, el método de reducción de colorantes (Reductasa), usando azul de metileno.<br />En el procedimiento se utilizan patrones de azul de metileno o Resazurina y se observa el proceso de reducción del colorante (de azul a blanco para el azul de metileno; de azul apizarrado a rosa o blanco para la Resazurina). El tiempo necesario para que se produzca la reducción del colorante está relacionado con el número de microorganismos de la muestra.<br />Teniendo en cuenta que los métodos de reducción no funcionan eficazmente en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitución de estas por otras técnicas rápidas.<br />OBJETIVOS<br />Determinar la calidad de las leches frescas por métodos rápidos y sencillos.<br />Analizar la importancia del control de la calidad de la leche cruda como materia prima de la Industria láctea.<br />Aplicar las pruebas del azul de metileno para comprobar la calidad sanitaria de la leche cruda.<br />Determinar la calidad de la leche para comprobar si es apta o es apta para el consumo humano.<br />III. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA<br />Determinación de la Calidad Microbiológica en la Leche Cruda<br />1. Sedimento: el sedimento obtenido por el método de lactofiltración mide la calidad sanitaria. La presencia de abundante partículas de sucio y su tipo (heces, insectos, tierra, restos de alimentos), puede indicar el cuidado que se ha tenido durante el ordeño y almacenamiento de la leche cruda.<br />2. Temperatura: la determinación de la temperatura en la recepción muestra el cuidado que se haya podido tener durante el trasporte y almacenamiento de la leche. Sin embargo una leche que se encuentre la temperatura óptima de refrigeración (4-5 ºC) no confirma que sea de buena calidad, ya que es posible que durante las fases que están desde el sitio de producción hasta la industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que hayan permitido la multiplicación microbiana.<br />3. Lactofermentación: esta prueba permite observar las características del coagulo obtenido de la fermentación de una muestra de leche incubada a temperatura ambiente (35-37 ºC) por 24 horas. Según las características observadas se puede presumir acerca del tipo de bacterias predominantes, ya que un coagulo homogéneo sin o con pequeñas burbujas de gas, indicara predominio de bacterias lácticas homofermentativas, por el contrario un coagulo grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias coliformes.<br /> Guía General para la Clasificación de la Leche según su Sabor<br />ClasificaciónPuntajeDescripción del sabor especificoExcelente40 - 45Sin criticismoBuena38 - 39, 5Sabor ligeramente astringente y salado, carente de frescura, sabor ligero o definido a cocido, a pienso o sin sabor.Regular36 - 37,5Sabor ligeramente a quot;
establoquot;
y oxidado; definitivamente astringente y salado carente totalmente de frescura, pronunciado sabor a cocido o sin sabor.Pobre35,5 o menosSabor ligero o definido a ácido, rancio y sucio; ligero, definido o pronunciado a quot;
establoquot;
, amargo, extraño, a ajo/ cebolla, a malta, metálico; definido o pronunciado a establo y oxidado; pronunciado astringente, a pienso y salado.InsalubreSin PuntajeSabor pronunciado ácido, rancio y a sucio.<br />Tomado de Nelson and Trout (1964): p 96. Se estima normal un Puntaje de 31 - 40.<br />4. Acidez Titulable y pH: ya se ha estudiado estas dos propiedades de la leche en el tema de físico químico. Esta claro que la fermentación microbiana modifica estos valores, aumentando la acidez y reduciendo el pH. Sin embargo hay que tener en cuenta que ciertos microorganismos proteolíticos pueden causar la coagulación dulce de la leche, es decir, sin acidez o con alcalinización de la leche.<br />5. Reducción de Colorantes: estas pruebas se fundamentan en como por el metabolismo microbiano hace variar el potencial de óxido reducción de la leche. Para ello se utilizan como indicador el azul de metileno y la Resazurina, los cuales van variando su coloración a medida que se van reduciendo.<br />PRUEBA DE LA REDUCTASA O REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO<br />El método de reducción del azul de metileno es un método indirecto para calcular el contenido total de bacterias de la leche. De manera que en lugar de contar las bacterias se establece una correlación entre el tiempo que se necesita para reducir el colorante de Azul de Metileno en la leche a una forma incolora y la probable población bacteriana de la muestra.<br />Por lo general, el tiempo que se necesita para la reducción del colorante, es inversamente oro al número de bacterias presentes en a leche.<br />Este método puede adaptarse para el examen de gran número de muestras en un tiempo corto, pero sin embargo, si la población bacteriana es alta, éste método no nos da información de la probable fuente de contaminación.<br />No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta prueba sean estériles, pero su contaminación puede reducirse al mínimo tratándolos con agua hirviente o vapor que circule libremente.<br />Tal como existe en la ubre, la leche posee un potencial de oxidación-reducción suficientemente bajo para reducir inmediatamente el azul de metileno. La incorporación de oxígeno durante el ordeño, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial Redox aproximadamente de + 0.06 a 0.01 voltios.<br />Se cree que en el mecanismo de la reducción del colorante durante la prueba, intervengan varios factores relacionadas entre sí, pero lo que si es seguro que el proceso respiratorio de las bacterias, elimina oxígeno de la leche, provocando un cambio en el potencial de Oxido-Reducción, puesto que, por lo general, el oxígeno mantiene un potencial positivo, y que, a medida que el potencial va cayendo, el hidrógeno pasa de los elementos constitutivos de la leche y de los metabolitos a1 azul de metileno, causando su reducción.<br />La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con que se obtienen los datos, es fácil, práctica y económica, sin embargo, este método tiene sus limitaciones y son las siguientes:<br /> La temperatura de incubación de 37°C (98.6°F) no es favorable para el metabolismo de todas las bacterias contenidas en la leche. Las distintas bacterias tienen capacidades diferentes en lo que respecta a rebajar el potencial de Oxido- reducción de la leche.<br />Por las siguientes razones:<br />Las bacterias termodúricas permanecen inactivas durante la prueba, y esta es la objeción más importante ya que estas bacterias son las que constituyen el mayor problema para el elaborador.<br />• Las bacterias sicrófilas y termófilas tendrán muy poca o ninguna actividad durante la prueba.<br />• Los materiales inhibidores de la leche impedirán también la proliferación de muchas bacterias y harán que la prueba dé indicación de una calidad más alta que la realmente existente.<br />IV. MATERIALES MUESTRA: <br />Leche fresca<br />MATERIALES<br />Baño María<br />Tubos de dilución<br />Azul de metileno<br />Pipetas estériles<br />V. METODOS <br />PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO<br />Se pipeteó 10 mL de agua destilada estéril en una botella y se le agregó 0.5 mL de la solución de azul de metileno.<br />Luego, con una pipeta de 10 mL tomamos esa misma cantidad de muestra de leche en un tubo de ensayo; luego lo pasteurizamos; una vez pasteurizado lo agregamos 0.5ml del azul de metileno. <br />Tapamos ambos tubos de ensayo con las muestras sin y pasteurizadas y lo agitamos.<br />Previamente debemos tener ya al baño María calentado a 37 ºC (± 0.1), verificar que en éste haya un control más y menos y un tubo con la muestra y el termómetro.<br />Luego, rotulamos los dos tubos, la muestra sin pasteurizar lo sumergimos en el baño María. <br />Revisar cada 30 min. <br />Si pasados los primeros 30 min. no “se vuelve blanco” el contenido del tubo, lo sacamos, lo invertimos suavemente 3 veces y lo volvemos a poner en el baño María por otros 30 min. y así hasta que el contenido se vuelva blanco.<br />Al final, anotamos el tiempo que demore en virar de color e interpretamos:<br />> 4h=Muy buena (A)Entre 3 – 4 h=Buena (B)> 30 min. a 3 h=Aceptable (C)< 30 min.=Inaceptable (D)<br />321320398948820159525<br />1. El colorante azul de metileno el cual es un indicador de oxido-reducción, es azul cuando está oxidado e incoloro cuando está reducido.<br />2. Varias especies de bacterias, no todas las que pueden contaminar la leche, tienen la capacidad de secuestrar el oxígeno presente en el medio y por lo tanto generar la reducción del azul de metileno con la consecuente pérdida del tono azul.<br />3. Básicamente la velocidad con la cual se reduce el azul de metileno depende del número de microorganismos que tienen el efecto reductor, es decir que a mayor número de bacterias con esa propiedad, menor será el tiempo necesario para que se produzca el cambio de color en el tubo. Esto es lo que comúnmente se describe en bacteriología como un recuento metabólico indirecto.<br />Internacionalmente la tabla de interpretación del TRAM se relaciona con las siguientes recuentos de bacterias /mL.<br />TRAM (minutos) No Bacterias /mL.< 30 minutos 20 - 30 millones30 min - 2 horas 4 - 20 millones2 - 6 horas 0,5 - 4 millones> 6 horas < 500.000<br />Como se puede ver en la tabla las variaciones pueden ser de número de bacterias para determinado rango de variación es muy variable, razón por la cual la prueba a nivel mundial ha perdido aplicación como elemento para medir el número de bacterias.<br />A lo anterior se suma el hecho de que un gran número de bacterias que hacen parte de la contaminación de la leche durante el ordeño tienen poca actividad reductora del azul de metileno y los números de bacterias para un determinado TRAM se ven incrementado en forma muy significativa, en aquellos ordeños donde las practicas de higiene son deficientes.<br />Trabajos realizados para comprobar la tabla internacional de TRAM a dado resultados muy diferentes en los países de Latinoamérica como se muestra en la siguiente tabla:<br />TRAM (minutos) recto mesófilos aerobios (UFC)< 30 min > 600 millones30 min - 1 hora 100 - 600 millones1 - 2 horas 25 - 100 millones2 - 3 horas 10 - 25 millones3 - 4 horas 5 - 10 millones4 - 5 horas 3 - 5 millones5 - 6 horas 2 - 3 millones6 - 7 horas 1.5 - 2 millones7 - 8 horas 1 - 1.5 millones8 - 9 horas 800.000 - 1 millón<br />Como se puede observar mientras que en la tabla internacional, 6 horas de TRAM significan menos de 500.000, en nuestro medio ese mismo tiempo corresponde aproximadamente a 2 millones de bacterias. Estas grandes diferencias se originan en la diversidad de fuentes de contaminación a que se ve sometida la leche cuando fallan las prácticas de higiene y se facilita la contaminación con microorganismos provenientes del intestino de los animales, que en general tienen muy poca actividad reductora, comparativamente con bacterias de los géneros Streptococcus y Lactobacillus que son habitantes normales de la glándula mamaria y que a través de ella pueden llegar a la leche.<br />Basados en la actividad metabólica de los diferentes microorganismos que pueden contaminar la leche, la prueba TRAM puede castigar leches que tienen poca contaminación ambiental pero con presencia de bacterias con gran capacidad reductora, como las mencionadas, y de otra parte favorecer a leches con alto número de bacterias contaminantes ambientales producto de ordeños antihigiénicos pero que demoran mucho en reducir el azul de metileno.<br />Otra razón para tener largo tiempo de TRAM frente a un alto número de bacterias es, que la leche examinada contenga sustancias que inhiban el crecimiento bacteriano, por ejemplo, preservantes químicos o antibióticos, compuestos que cuando se está haciendo el Recuento en Placa, por el factor de dilución a que se somete la muestra, pierden actividad o capacidad inhibitoria.<br />El hecho de tener cortos tiempos de TRAM y Recuentos bajos de bacterias, es posible cuando varias células bacterianas se encuentran agrupadas y una Colonia (UFC) es el resultado de uno de estos grupos o de una sola célula. Por esto en los recuentos de Bacterias Mesófilas se usa el término Unidades Formadoras de Colonia (UFC). En la Prueba de TRAM el hecho de que las bacterias estén agrupadas o separadas no influye porque independientemente cada célula cumple su acción metabólica.<br />Resultados:<br />La muestra que se trajo a analizar viró de color a 2 horas después de ponerla en el baño María, por lo que se puede interpretar que es una leche aceptable.<br />A la media horaA una horaA hora y mediaA dos horas159448514224011684014605043402551420332966085141605<br />2224375238967En la muestra pasteurizada no vira de color porque se ha eliminado toda la flora microbiana.<br />Debido al tiempo transcurrido en el cambio de viraje podemos decir que nuestra muestra tenia un rango entre 4 - 20 millones Nº Bacterias /mL, lo cual la leche lo clasificamos como apta para el consumo.<br />A más tiempo que demore en virar el color de la reacción con el azul de metileno; quiere decir que esa leche esta en mejores condiciones de consumo. <br />DISCUSIONES<br />De acuerdo a las investigaciones realizadas por los integrantes de nuestro grupo no estamos de acuerdo con los autores FRAZIER y JAY que nos indican que el azul de metileno es también llamado reductasa debido a que la reductasa es una enzima que no tiene influencia en la decoloración del azul del metileno. <br />El verdadero principio para que el azul de metileno se descolore es lo siguiente: el potencial de óxido-reducción (Eh) de la fresca aireada es de +0,35 a + 0,40 voltios (350 a 450 milivoltios), el cual se debe principalmente al contenido de oxígeno disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese oxígeno es separado, el Eh disminuye Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y disminuyen el oxígeno. Si el número de microorganismos es muy elevado, el consumo de oxígeno será muy elevado y por consiguiente el Eh caerá rápidamente; si por lo contrario los microorganismos son pocos, el Eh disminuirá lentamente.<br />También se debe tenerse en cuenta es que las clasificaciones dadas no siempre son apropiadas ya que existen otros factores que pueden afectar al tiempo de reducción, entre ellos, el tipo de microorganismos, el numero de leucocitos, el tiempo de exposición a la luz, la cantidad de oxigeno disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la superficie a medida que se va separando la crema del tubo de prueba. Así es como ciertos microorganismos ( lactococcus lactis) son más activos en su capacidad reductoras que otros, mientras que existen especies que son menos activas en ese sentido (streptococcus agalactiae, bacillus subtilis, microorganismos termodúricos)<br />VIII. CONCLUSIONES<br />La calidad higiénica de la leche ocupa en estos momentos una gran prioridad, para las industrias lácticas, es por eso los productores deben de producir su producto con el mas riguroso cuidado.<br />La utilización del TRAM, tiempo de reducción del Azul de metileno, es un método practico de los tantos existentes y que nos facilitan para analizar la calidad microbiológica de nuestra leche.<br />Mediante nuestra práctica realizada para lograr una coloración demoro más de 1h a 2h; para virar del color azul al blanco, lo cual esto nos da a conocer que nuestra leche analizada esta dentro del rango permitido y lo cual si esta apto para el consumo humano.<br />Logramos determinar una cantidad aproximada de microorganismos existente en nuestra leche, lo cual nos permite garantizar que nuestro producto está apto para el consumo humano. <br />IX. CUESTIONARIO<br />Cuál es el fundamento bioquímico de la prueba de la decoloración del azul de metileno.<br />El verdadero principio para que el azul de metileno se descolore es lo siguiente: el potencial de óxido-reducción (Eh) de la fresca aireada es de +0,35 a + 0,40 voltios (350 a 450 milivoltios), el cual se debe se debe principalmente al contenido de oxígeno disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese oxígeno es separado, el Eh disminuye Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y disminuyen el oxígeno. Si el número de microorganismos es muy elevado, el consumo de oxígeno será muy elevado y por consiguiente el Eh caerá rápidamente; si por lo contrario los microorganismos son pocos, el Eh disminuirá lentamente.<br />Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.<br />explique en qué situaciones dentro de una empresa de procesamiento de leche es que se realiza esta prueba, por qué y para qué?<br />Sirve entre ciertos límites, para indicar el grado de conservación y pureza de la leche, usando una prueba química para completar el examen bacteriológico; siendo este ensayo considerado como una medida de la contaminación bacteriana.<br />Para saber si la materia prima adquirida que es la leche cruda esta en buenas condiciones para el consumo humano, y si no pues no procesarla porque generaría mayor daño a la salud de los consumidores.<br />> 4h=Muy buena (A)Entre 3 – 4 h=Buena (B)> 30 min. a 3 h=Aceptable (C)< 30 min.=Inaceptable (D)<br />X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS<br />FRAZIER. W. 1992. Microbiología de los Alimentos. 4ta edición. Editorial Acribia. Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Métodos de Laboratorio en Microbiología de los alimentos y productos. Lácteos. 3ra Edición. Editorial Acribia. Zaragoza.<br />JAY. J.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. 2da Edición. Editorial Acribia. Zaragoza.<br />MORENO M., M.; M. T., SILVA G. y CALDERON M., W. (2006). Guía de Prácticas: Microbiología General. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo Facultad de Ciencias Biológicas. Lambayeque.<br />DAVILA FERNANDEZ, N. y HERNANDEZ GARCIA, J. M. (2006). Métodos de ensayos rápidos de detección de microorganismos en la leche.<br />Links investigados<br />http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/materialdeapoyoparapruebasdeplataforma_1693.pdf<br />http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf<br />http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/notas_de_microbiologia_de_los_al.htm<br />http://www.anmat.gov.ar/anmat/drvisapi.dll?MIval=fna_show_monog&ID=AZUL_DE_METILENO<br />http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf<br />http//:www.senasa.gob.pe/<br />