Flores Galindo, A. - La ciudad sumergida. Aristocracia y plebe en Lima, 1760-...
Traducción - Genética
1. 1
TRADUCCION - Biosíntesis de Proteínas
- 1950s
Proteínas: arreglos de solo 20
aa en forma no azarosa
- Ribosomas: lugar de síntesis
de proteínas
- 1960s polisomas, tRNAs
- 1961 Jacob y Monod
Teoría del mensajero
-1964s confirmación de mRNA
intermediario informacional
5. 5
Aminoacil-tRNA sintetasas
• Une los aa al correcto tRNA
• 20 enzimas diferentes
• Requiere ATP
Reconocimiento del tRNA:
puntos de contacto entre tRNA y
sitio activo de proteína (1–5 sitios,
muchas veces incluye anticodon)
6. 6
tRNA
Une un aa específico en la terminación 3´
tRNAs isoaceptores con anticodones diferentes unen el mismo aa
(varios codones para un aa)
Hay varias especies de tRNA que pueden reaccionar con el mismo
codon
El anticodon hace apareamiento de bases con un codon de mRNA (o
mas), la tercer base de codon con la primer base de anticodon puede
aparear con otras bases además del apareamiento tradicional
(Wobbling)
7. 7
60S subunit
40S subunit
Ribosomas
4 sitios de binding
mRNA-binding site
A site (aminoacyl)
P site (peptidyl)
E site (exit)
Procariotas :
subunidades 30s y 50s
9. 9
INICIACION
Procariotas Eucariotas
Tienen en común
-Disociación de ribosomas en subunidades
-Formación complejo preiniciación en subunidad menor
-Unión de complejo preiniciación a mRNA
-Iniciación mediada por factores
-Tanscripción- traducción acopladas -Iniciación citoplasmática
Iniciación en mRNAs que se
están transcribiendo
-Reconocimiento de sitio de iniciación - Estrategias diferentes para
por interacción mRNA-RNAr reconocimiento de sitio de
(Secuencia Shine-Dalgarno) iniciación
5´-UAAGGAGGU-3´ Traducción Cap-dependiente
“scanning”
Traducción Cap-independiente
(IREs)
-3 Factores de iniciación (IF1,IF2,IF3) - 13 factores diferentes
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Mecanismos de iniciación
Iniciación cap dependiente y cap independiente
cap-dependiente (Kozak, M 1978)
- Reconocimiento m7G-cap en extremo 5´
- Unión de subunidad 40s
- scanning hasta AUG iniciador
*Leaky scanning
*Ribosoma Shunting
*Reiniciación
cap-independiente (1988-Picornavirus)
Unión directa de subunidad ribosomal 40s en sitio interno sobre
mRNA denominado IRES
INICIACION
11. 11
INICIACION cap dependiente
3 Pasos
1) Formación del complejo de preiniciación 43 S
Unión del iniciador tRNAi
Met a la subunidad menor
2) Unión de complejo 43 S a mRNA
3) Localización codón de iniciación (scanning)
4) Unión de la subunidad mayor del ribosoma
Cada uno de los pasos de la iniciación de la traducción es facilitado
por por proteínas denominadas Factores de iniciación.
EUCARIOTAS
15. 15
Interacción entre factores y regulación de iniciación
Interacción entre
cap y poli A
Sinergismo que
estimula inicio de
traducción-
circularización de
mRNA
16. 16
Reconstitution of the eIF4E/GST-
4G1f/Pab1p Complex
(A) Reconstitution with Pab1p
immobilized on poly(A)-Sepharose resin.
Pab1p bound to poly(A)-Sepharose resin
was incubated with the indicated GST-
4G1f proteins and eIF4E. Bound proteins
were eluted with buffer containing SDS,
resolved by SDS–PAGE, and visualized
by Western analysis with the
appropriate antibodies.
(B) Reconstitution with eIF4E
immobilized on the cap-analog resin
7mGDP-agarose. eIF4E bound to the
resin was incubated with the indicted
GST-4G1f proteins and
Pab1p/poly(A)125 complexes. Bound
proteins were analyzed as in (A).
17. 17
If the dsRNA is incubated with GST-4G1f-459, Pab1p, and eIF4E (D), most of the
dsRNA is linear although some circles are observed (lower left corner). In the
presence of GST-4G1f, Pab1p, and eIF4E (E and F), much of the dsRNA is in a
circular conformation with a protein complex positioned where the ends of the RNA
meet. Differences in the apparent width of the RNA result from variation in the tip
and imaging force used to generate each image
19. 19
CODON INICIACION
- AUG codon iniciación predominante en eucariotas y exclusivo
en levaduras
AUG mas próximo a 5 ´es iniciación en mayoría de mRNAs
- Secuencia que rodea el AUG es critica :
Pu X X A U G Pu C C Pu C C A U G G
-3 +1 +4 -3 +1 +4
Presencia de estructura 2ª downstream AUG aumenta iniciación a
partir de ese sitio
- Factores eIF1, eIF5 ,eIF2 importantes en reconocimiento de
AUG
- Estructura secundaria del 5´leader mRNA (puede impedir
unión y/o scanning de los ribosomas)
Scanning
20. 20
Esquema del fundamento del método de toeprinting
Estrella: primer de oligonucleótidos marcado
radiactivamente.
Flecha entera: RNAm.
Flecha punteada: extendido por la transcriptasa reversa.
22. 22
INICIACION
Mecanismos no clásicos de Iniciación
-Leaky scanning :
AUG en contexto débil , carente de Pu en –3 y G en +4
2 proteínas diferentes == N-terminal
== secuencias enteras
-Reiniciación:
Comienza y termina la traducción a partir de un uORF. La subunidad
40s queda unida al mRNA se recarga de factores y comienza la
traducción en el siguiente AUG.
23. 23
Leaky scanning
AUG
CUG, GUG, UUG codones de iniciación raros
Codones = a AUG son usados como sitios iniciación suplementarios
CUG upstream es usado a veces, 1er AUG siempre
24. 24
The autoradiograms show [35S]Met-
labeled proteins synthesized in vitro
from capped mRNAs that encode
chloramphenicol acetyltransferase.
(A) Initiation at AUG#1 generates an
N-terminally extended protein,
labeled preCAT. A suboptimal context
around AUG#1 allows some ribosomes
to scan past that site and initiate
instead at AUG#2. This leaky
scanning produces a shorter protein,
labeled CAT. (B) All mRNAs have a
suboptimal context (U in position −3)
around the first AUG codon and,
except for the control in lane 1, a
moderately stable base-paired
structure between the first and
second AUGs. The only variable is the
distance (n) between AUG#1 and the
base of the hairpin structure. When
properly positioned, the downstream
base-paired structure apparently
suppresses leaky scanning (lane 4). A
full description of these constructs
and the adjustments required for the
rabbit
D F
27. 27
cap-independiente
IRES
Internal ribosoma entry sites
IRES : Zonas con estructuras complejas (5´UTRs)
Poca similitud en cuanto a secuencia y tamaño. Su
actividad depende de integridad estructural.
Se definen funcionalmente
Inicialmente se descubrieron en Virus
3-5% mRNAs celulares se traducen por mecanismo cap-
independiente
IRES presentes en 5´UTR
33. 33
FIG. 2. The BCL-2 5-UTR functions as an IRES in vitro. The DNA constructs
depicted (panel A) were transcribed in vitro in the presence of the m7G cap analog, then
translated in nucleased RRL, and resolved via SDS-PAGE and autoradiography.
34. 34
Regulación de iniciación de traducción
Niveles de regulación:
1) Estructura de mRNA:
- Accesibilidad de cap
- uORFs y ORF dentro de secuencia codificante
- Contexto de AUG
- Estructura secundaria de mRNA
2) Actividad y Fosforilación de factores de iniciación
3) Interacciones Proteína-RNA
4) Interacciones RNA-mRNA
35. 35
Regulación de unión de subunidad 40S al mRNA
a) Proteínas 4E-BPs:
NO Fosforiladas ………..interacción con eIF4E .................. Traducción
Fosforiladas………… no interacción con eIF4E…………. Traducción
PI3-K, Akt y FRAP/mTOR (quinasas involucradas en fosforilación)
b) Disponibilidad de eIF4E y fosforilación
eIF4E poco abundante y limitante.
Fosforilación en Ser209 ...................................... Traducción
Fosforilación de eIF4E en Ser 209 inhibe unión a cap si ocurre previo a
interacción cap-eIF4E y estimula si ocurre después de interacción cap-
eIF4E. MNK1 (quinasa)
Actividad y Fosforilación de factores de iniciación
36. 36
c) eIF4G: Clivaje y disponibilidad
En apotosis o infecciones virales por proteasas .............. Traducción
b) eIF2 fosforilación
eIF2-P (Ser51) Mayor afinidad por GDP ……………………. Traducción
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FIG. 1. Shutoff of host protein synthesis and cleavage of eIF4GI and eIF4GII upon poliovirus infection. (A) Pattern of
protein synthesis. HeLa cells were mock-infected or infected with poliovirus (100 pfu per cell), and labeled for 30 min with
[35S]methionine at the indicated times after infection, and equal amounts of cytoplasmic protein extracts (5 mg) were
subjected to SDSy15% PAGE. The arrows indicate viral capsid proteins.
(B and C) Analysis of eIF4GI and eIF4GII cleavage. Proteins (40 mg) of samples as in A were resolved by SDSy6% PAGE,
transferred to nitrocellulose paper, and incubated with a polyclonal antibody against the N-terminal fragment of eIF4GI
(B) or eIF4GII (C)
eIF4G: Clivaje y disponibilidad
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Regulación traduccional durante el estrés celular
Disponibilidad del
complejo ternario
eIF2-P (Ser51)
Mayor afinidad por GDP
Inhibe traducción
general
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[aa] GCN2 kinasa eIF2a P GCN4
traducción
general
Regulación de traducción de GCN4
GCN4 : activador transcripcional (biosíntesis de aa) en
levaduras
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Interacciones Proteína-RNA
Regulación expresión
genes involucrados en
metabolismo de hierro
(ALA, TfR, mitocondril
aconitase;etc)
Proteínas (IRP) que se
unen a IRE: iron
responsive elements
(hairpin) en 5´o 3´UTR
Evita degradación
Inhibe interacción 4G-3F
Inhibe interacción 4G-3F
