El documento proporciona información sobre la técnica de electroforesis en gel de agarosa. Explica que la agarosa es un polímero natural utilizado para construir geles que permiten separar moléculas de ADN mediante electroforesis. Describe los pasos para preparar el gel de agarosa, cargar las muestras y realizar la electroforesis, y visualizar luego el ADN mediante tinción y transiluminación.

1. PCR
GEL DE AGAROSA

2. Agarosa
L a a g a r o s a e s u n p o l í m e r o n a t u r a l ,
p o l i s a c á r i d o f o r m a d o p o r g a l a c t o s a s a l f a y
b e t a q u e s e e x t r a e d e l a s a l g a s d e l o s
g é n e r o s G e l l i d i u m y G r a c i l l a r i a
S o l u b l e a t e m p e r a t u r a s u p e r i o r a l o s 6 5 º C
Te m p e ra t u ra d e g e l i f i c a c i ó n v a r í e e n t re
l o s 1 7 y l o s 4 0 º C
S u u s o m á s e x t e n d i d o e s p a r a c o n s t r u i r
g e l e s q u e p e r m i t a n s e p a r a r m o l é c u l a s d e
A D N m e d i a n t e e l e c t r o f o r e s i s

3. Gel de agarosa
El tamaño de poro efectivo
de los geles de agarosa se
puede estimar a partir de
gráficos de Ferguson de
moléculas de ADN de
diferentes tamaños

4. Peso de agarosa
Ilustración 2: Rango de separación de tamaños de ADN en función de la
concentración y el tipo de agarosa utilizados (Stellwagen, 2010).

5. Protocolo
Ilustración 3: Etapas de la
técnica (Fierro).
1. Preparación del gel agarosa
2. Preparación de las muestras
3. Carga de las muestras y corrida
del gel
4. Tinción del gel y visualización del
ADN

6. Preparación del gel agarosa
Ilustración 4:Un gel de agarosa
solidificado después de retirar el peine
(Lee, Costumbrado, Hsu, & Kim, 2012)
1. Pesar la cantidad de agarosa necesaria para obtener la concentración
deseada en función del volumen de gel.
2. Añadir la agarosa al buffer en un matraz.
3. Calentar la mezcla en un horno de microondas hasta que se observe
que toda la agarosa se ha fundido.
4. Dejar enfriar la solución de agarosa hasta una temperatura de unos 50
°C.
5. Mientras la solución de agarosa se enfría, preparar el molde en el que
se va a hacer el gel sellando los bordes con cinta masking, o
colocándolo en el dispositivo previsto para ello, y colocando el peine
en la posición deseada.
6. Verter cuidadosamente la solución de agarosa sobre el molde nivelado
y dejar que solidifique durante al menos 30 min.

7. Preparación de las muestras
Ilustración 5:Una estudiante que agrega colorante
de carga a sus muestras de ADN (Lee,
Costumbrado, Hsu, & Kim, 2012)
Mezclar tanto las muestras de ADN
como el marcador de tamaño con 0.2
volúmenes del buffer de carga 6x. El
volumen total estará determinado por el
tamaño de los pocillos, habitualmente
15-30 µl

8. Carga de las muestras y corrida del gel
Ilustración 6:Un estudiante cargando la muestra
de ADN en un pozo del gel. (Lee, Costumbrado,
Hsu, & Kim, 2012)
1. Una vez que el gel ha solidificado retirar el sellado de los bordes y
colocar el molde con el gel en la cámara de electroforesis.
2. Añadir buffer de electroforesis hasta que cubra el gel unos 3-5 mm.
3. Retirar cuidadosamente el peine para que queden libres los pocillos
para las muestras.
4. Cargar en los pocillos las muestras que se prepararon en el paso.
5. Conectar los cables a la fuente alimentación y aplicar un voltaje de
20-150 V
6. Correr el gel hasta que el colorante azul de bromofenol esté a una
distancia del borde de aproximadamente un 25% de la longitud total
del gel. En ese momento debe detenerse la electroforesis.

9. Tinción del gel y visualización del ADN
Ilustración 7: Imagen de una electroforesis post-
gel. El gel se expuso a luz ultravioleta y la
fotografía se tomó con un sistema de
documentación de gel (Lee, Costumbrado, Hsu,
& Kim, 2012).
1. Si no se añadió el BrEt al gel, éste debe teñirse una vez
finalizada la electroforesis. Para ello se saca el gel de su
molde y se sumerge en una solución de BrEt (0.5 µg/ml)
durante al menos 15 min.
2. Colocar el gel sobre un transiluminador y encender la lámpara
de luz ultravioleta (λ ≈ 300 nm), el ADN se visualizará como
bandas de color anaranjado.
3. Si hay bandas de tamaño pequeño que no se visualizan bien
puede hacerse una etapa de desteñido con H2O o 1 mm
MgSO4 durante 20 min.
4. Fotografiar el gel con el sistema fotográfico disponible.

10. https://www.youtube.com/watch?v=mRUAAq3hACY
Electroforesis Electroforesis en gel agarosa
https://www.youtube.com/watch?v=U1g2qt3juZw

11. PCR EN
TIEMPO REAL

12. Fundamento
• El objetivo de la PCR en tiempo real ha sido detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos
mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción.
• El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la
reacción y por su parte, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN
en la muestra.
• Estas últimas dos características representan grandes ventajas de la PCR en tiempo real, ya que el producto de
amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción sin que haya la necesidad de que sea manipulado
en un gel de agarosa para conocer si la reacción fue exitosa como sucede en la PCR.

13. Equipos para realizar la
PCR en tiempo real
Termociclador Fluorómetro

14. Equipos para realizar la PCR en tiempo real
A) Mecanismo de incorporación del SYBR Green. Durante la
alineación del iniciador, el SYBR Green se incorpora en la doble
cadena. La señal de fluorescencia incrementa de manera proporcional a
las moléculas de doble cadena producidas en la amplificación.
Una sonda es una secuencia de ADN o ARN de
cadena simple que se utiliza para encontrar su
secuencia complementaria en el genoma de una
muestra
• Sondas de Hidrólisis
• Sondas de Hibridación
• Sondas de Horquilla
Fluoróforos con afinidad por el ADN Sondas

15. Sondas de hidrólisis
Taq Man
Ilustración 11: Estructura y mecanismo de acción de
la Sonda TaqMan (Navarro, Serrano-Heras, Castaño,
& Solera, 2015)
Ilustración 12: Método específico mediante la
utilización de las sondas TaqMan. (L, C, & C, 2013)

16. CYBR Green
Ilustración 13: Método no específico. Cuando el
CYBR Green está unido al ADN de doble cadena, es
excitado a una longitud de onda de 480 nm, mientras
que la longitud de onda de emisión corresponde a
50nm (L, C, & C, 2013).

17. Sondas de hibridación Sondas de Horquilla
En este caso se utilizan dos sondas específicas
que hibridan con la secuencia del ADN de
interés.
En estas sondas, un oligonucleótido marcado en su
extremo 5’ con un reportero y el 3’ con un apagador, se
encuentran formando una horquilla, estructura que los
mantiene cercanos para poder llevar a cabo la
transferencia de energía y mantener al reportero
apagado.

18. Protocolo Ilustración 14: Etapas de la
técnica (Aguilera, Tachiquín,
Munive, Olvera, &
Cárdenas).

19. 1. Preparar una curva de calibración (ADN) con estándares certificados a diferentes concentraciones .
2. Reacciones de amplificación. Preparar por duplicado la mezcla de reacción, una para el marcador
endógeno y otra para p35s.

20. 3. Las muestras del ADN que van a ser analizadas deben mantenerse en hielo hasta que se coloquen en la placa o
en los tubos PCR. Procesar cada muestra por duplicado.
4. Todos los reactivos para la PCR deberán descongelarse y homogeneizarse, cuidadosamente. Mantenerse sobre
hielo y tapados para evitar que reciban la luz directa.
5. Colocar 23 µL de la mezcla de reacción en cada tubo .
6. Agregar 2.0 µL del ADN problema a cada tubo .
7. Una vez preparadas las mezclas, centrifugar los tubos para eliminar burbujas que pudieran interferir con la
lectura de la fluorescencia y la solución quede en el fondo de los tubos.
8. Preparar el equipo y programar las condiciones para la amplificación.
9. Ejecutar el programa.
10. Obtención de datos.

22. PCR en tiempo real
https://www.youtube.com/watch?v=C_luFY8mG2g https://www.youtube.com/watch?v=vLya5A_TlPs
Real Time PCR Detection Kits.
Extracción de ácidos nucléicos &
Protocolo de Iniciación

23. PCR
RETROTRANSCRIPTASA

24. Fundamento
• Ahorro de tiempo
• Sensibilidad extrema
• un amplio rango dinámico
La PCR cuantitativa en tiempo real es un método altamente sensible para cuantificar la cantidad absoluta o
relativa de una secuencia de ácido nucleico específica en la que la acumulación de productos de PCR a lo largo
del tiempo se mide directamente.
El paso de información de RNA a DNA puede ser posible a la acción de un enzima particular denominada
transcriptasa inversa o retrotranscriptasa.
La técnica de la qRT-PCR permite analizar la expresión génica y compararla en distintas condiciones.
Las aplicaciones comunes de qPCR incluyen el perfil de expresión génica, la cuantificación de la carga viral.

25. ETAPAS

26. OBTENCIÓN, AISLAMIENTO Y
PURIFICACIÓN DEL mRNA
1. En una hoja Excel calcular el volumen que hay
que añadir de cada muestra para preceder a la
eliminación DE gDNA.
2. Hacer los cálculos necesarios.
3. Pipetear los volúmenes correspondientes en tubos
libres de RNAsas, siguiendo estrictamente las
normas para no contaminar las muestras
4. Incubar 3 minutos a 42ºC .
5. Pasar inmediatamente a hielo.

27. Ilustración 16: Estructuras DNA y RNA. Diferente composición
de bases nitrogenadas

28. RETROTRANSCIPCIÓN
La retrotranscripción (reacción RT) es un proceso por el que una
hebra de RNA se retrotranscribe en una cadena complementaria,
que llamamos cDNA.
Enzima retrotranscriptasa dNTPs Cebador
Buffer
Primers
• Primer oligo
• Primers específicos
• Random primers

30. Protocolo
1. Se parte de máximo 1 µg de RNA.
2. Se añaden, a cada muestra, las cantidades
necesarias de enzima RT y de buffer RT
3. Preparamos uno de los controles necesarios
para la qRT-PCR: control RT-
4. Incubar todas las muestras y sus controles 15
minutos a 42ºC
5. Inactivar el enzima: 3 minutos a 95ºC
6. Guardar en hielo o almacenar a -20ºC hasta la
realización de la qRT-PCR.

31. AMPLIFICACIÓN DEL cDNA
Ilustración 18: Sonda Taq Man intacta y rota por la acción de la
DNA polimerasa
Fase de desnaturalización del
cDNA
Fase de annealing
Fase de elongación

32. Ilustración 20: Fases de la
qRT-PCR. Durante la
elongación, se produce la
liberación de la molécula
fluorescente de la sonda Taq
Man

33. Protocolo
Referencia Activa
Referencia pasiva

34. Control RT-
CONTROL NTC
CALIBRADOR

35. Diseño de placa e inicio de la programación
• El soporte donde se lleva a cabo la reacción es una placa de 96 pocillos.
• En nuestro caso, nuestra referencia activa será el gen que codifica el enzima gliceraldehido3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH).
• Añadir los controles RT- y NTC
• Teniendo en cuenta que cada muestra y su control deben probarse por duplicado, diseñar las placas que nos
permita en análisis de los genes INS1, INS2 y GADPH.
• Una vez diseñada la placa, en cada pocillo, se pipetearán los volúmenes correspondientes para obtener un
volumen final de 20 μl, que incluya los siguientes componentes:
• Mix (DNA polimerasa, dNTPs, cofactores,) 10 μl
• Sonda TaqMan específica para cada uno de los tres genes junto a su pareja de primers correspondiente 1 μl
• H2O 5 μl
• Muestra de cDNA o su correspondiente control RT- o Agua (NTC): 4 μl.

36. Se irá realizando el diseño y ajuste de los parámetros en
el programa correspondiente teniendo en cuenta que ha
sido programado previamente
1. Seleccionar los genes que vamos a estudiar
de la lista existente:
2. Identificar en cada pocillo, qué gen es el que vamos
a estudiar, y de qué paciente se trata. Colocar también
los controles NTC y RT-

37. Visualización de los resultados
Análisis
1.Eliminar los pocillos cuya
medida se observe alterada
2. Ajustar el umbral de detección
determinado automáticamente por
el software, situándolo en la zona
lineal, en dos puntos diferentes y
observar los cambios en los Ct.

38. Cada gen debe ser analizado por separado y en conjunto para todas las muestras del experimento que estamos
llevando a cabo. Es decir, habrá que establecer un umbral único para INS1 en TODAS las muestras (no para NTC
ni para RT- ). Otro distinto para INS2 y otro distinto para GAPDH.

39. Observar estos cambios en el display de los datos “Plate” (Cts de cada uno de los pocillos).

40. Cuantificación relativa: Método 2-ΔΔCt
1. En la plantilla de Excel calcular el incremento de Ct (ΔCt). Para ello, se resta a la media de los
Cts del gen a evaluar (INS1 e INS2) la media de los Cts del gen control (GAPDH) en cada
muestra.
2. Representar las gráficas de los valores de ΔCt por un lado, y de los valores de 2-ΔΔCt

41. PCR RETROTRANSCRIPTASA
https://www.youtube.com/watch?v=skSnYfqYVCg https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4
Coronavirus Test: Real time RT-PCR