Holland N., et al, "Biological sample collection", 2003

1. BIOLOGICAL SAMPLE
COLLECTION AND PROCESSING
FOR MOLECULAR
EPIDEMIOLOGICAL STUDIES
Holland N., Smith M., Eskenazi B. y Bastaki M.
School of Public Health, University of California,USA.
Mutation Research 543 (2003) 217-234.
BIOBANCO DE TEJIDOS Y
FLUÍDOS DE LA
UNIVERSIDAD DE CHILE

2. Introducción
Epidemiología
+
Biología Molecular
Epidemiología Molecular
• Métodos de la epidemiologia tradicional.
•Conocimiento de eventos moleculares que se
desarrollan en la enfermedad.
Biomarcadores
Describen los eventos moleculares característicos de varios estadios entre la
exposición al agente patogénico y el desarrollo de la enfermedad.
Susceptibilidad
FACTORESGENÉTICOS
FACTORESAMBIENTALES

3. Introducción
¿ QÚE AVANCES HA PERMITIDO EL
DESARROLLO DE LA EPIDEMIOLOGÍA
MOLECULAR?
Conocimiento sobre mecanismos de toxicidad.
Evaluar causalidad entre riesgos específicos y efectos biológicos.
Evaluar con mayor precisión el riesgo de exposición a factores específicos.
Diferenciar entre grupos de alta y baja susceptibilidad.
Entregar soporte científico sólido en la implementación de estrategias
de intervención.

4. Introducción
Desarrollo continuo de nuevas herramientas en el
campo de la bioquímica y biología celular y molecular
deben ser consideradas en el diseño de estudios y sus
procedimientos.
•Preparación de las muestras
•Preservación de las muestras
•Almacenamiento de las muestras
Disposiciones a considerar en estudios epidemiológicos
y de monitoreo
IMPORTANCIA DE LA CREACIÓN DE COLECCIONES
BIOLÓGICASY BIOBANCOS.

5. Propósito
Discutir los cambios y potenciales obstáculos de la colección de
muestras, procesamiento y creación de Biobancos.
Discutir los factores que afectan la calidad de las muestras.
Discutir el potencial uso de las muestras biológicas a largo plazo.
Discutir consideraciones durante la colección, procesamiento y
Almacenamiento de las muestras.

6. Desafíos de la Epidemiología
Molecular
Figura 1: Esquema de la estructura de estudios de epidemiología molecular o de
biomarcadores, 2 definiciones utilizadas como sinónimos.

7. Desafíos de la Epidemiología
Molecular
Obtener una gran cantidad de información de un número de
muestras limitado.
Tener consideraciones para la evaluación de futuros
biomarcadores.
Maximizar la información que puede ser obtenida de las muestras
almacenadas con el objetivo de minimizar los costos de
investigaciones.

8. Diseño del estudio
Identificar el tipo de muestra que es necesario colectar dependiendo
de la herramienta molecular que se desea implementar.
Los nuevos avances moleculares requieren de colecciones de
muestras y procesamientos de éstas más estrictos.
Ejemplo:
Para estudiar la exposición a formaldehido por
inhalación se debe colectar células exfoliadas de la nariz o
boca.

9. Diseño del estudio
Definir biomarcadores a estudiar.
Dependiendo de los biomarcadores potenciales a
estudiar se definirá :
•Tipo de muestra a colectar y almacenar.
•Condición de toma de muestra.
•Tiempo y condiciones de almacenamiento.
• Transporte de las muestras.
• Procesamiento de las muestras.

10. Consentimiento Informado
•Normas éticas y legales.
•Informar a donantes sobre el futuro uso de las muestras.
•Entrenamiento y certificación.

11. Colección de muestra
Interacción entre los sujetos estudiados, personal a cargo y
los investigadores.
Comunicación clara (Creación de protocolos).
Personal apropiado para colecciones de muestras
especiales.
Reducción de dificultades prácticas en colección de muestras.
Campañas de información a sujetos.

12. Colección de muestra
Métodos no invasivos para colección de la muestra
Evaluar cuál es el método de colección menos
invasivo para cumplir el objetivo deseado.
Minimizar la cantidad de muestra necesaria.
Métodos menos invasivos incrementa el número de
individuos dispuestos a ser donantes.
Considerar en caso de dificultades geográficas.

13. Colección de muestra
Selección de tiempo optimo para colección de muestra
Variaciones en niveles de biomarcadores
•Variación durante el día
Ej.:Variación de metabolitos en orina.
• Múltiples tomas de muestra
Ej.: Evaluación de niveles de mercurio en mujeres.
• Seleccionar el momento preciso de la toma de muestra.
Ej.: Enfermedades en que la variación del biomarcador es
en un lapso de tiempo corto y otras en que la toma de
muestra debe ser con mucha antelación.

14. Colección de muestra
Estabilidad de las muestras
Factores que afectan la estabilidad
• Anticoagulantes : Seleccionar dependiendo del propósito analítico
de la muestra.
Ej.: EDTA óptimo para ensayos con ADN
Citrato sódico alto rendimiento en cultivo linfocitario, ADN y ARN.
Heparina altera la proliferación linfocitaria y se une a proteínas.
• Agentes estabilizantes: Muchos biomarcadores son lábiles y será
necesario seleccionar el agente estabilizante indicado que no
interfiera en análisis posteriores.
Ej.: EDTA y ácido ascórbico son estabilizadores para folatos en
sangre.

15. Colección de muestra
Estabilidad de las muestras
Factores que afectan la estabilidad
•Tiempo pre-procesamiento: Dependiente de el componente de la
muestra que nos interese mantener estable.
Ej.: Alta viabilidad celular dentro de 24-48 horas de sangre, células
bucales y orina.
Hay biomarcadores que pese a la presencia de agentes
estabilizantes son afectados en tiempos largos (24 horas).
Necesario considerar en algunos casos el tiempo de transporte ya
que hay biomarcadores que debiesen ser excluidos.

16. Colección de muestra
Estabilidad de las muestras
Factores que afectan la estabilidad
•Temperatura: Puede afectar la estabilidad en el tiempo entre la
toma de muestra y procesamiento y durante cortos o largos
tiempos de almacenamiento.
La temperatura depende del biomarcador estudiado.
Idealmente la muestra debe ser separada en sus componentes para
almacenar bajo condiciones indicadas.
Se debe controlar la temperatura en cada punto del flujograma.
Evitar ciclos de congelamiento y descongelamiento no necesarios.

17. Colección de muestra
Estabilidad de las muestras
Factores que afectan la estabilidad
•Esterilidad: Esencial para extracción de ADN, ARN y cultivo celular.
Contaminación puede introducir nuevos productos y metabólitos
en las muestras.
•Degradación: Degradación enzimática puede afectar a
biomarcadores (Proteínas, ADN, ARN…).
Sustancias y condiciones que permiten evitar procesos de
degradación.

18. Colección de muestra
Contenedores/equipamiento
El tamaño y característica del recipiente depende de:
Tipo de muestra
Volumen a colectar
Medio de transporte a laboratorio
Costo
Condiciones de almacenamiento
Eficiencia
Tipo de análisis
La característica del contenedor de almacenamiento final
tiene gran importancia.

19. Colección de muestra
Seguridad
Tejidos humanos son potencialmente infecciosos y
generalmente no se realizan perfiles patogénicos
para evaluar el riesgo de cada muestra colectada.
Entrenamiento para personal encargado de procesamiento,
transporte, colecta, almacenamiento…
Protección a personal para evitar su contaminación y la de
las muestras colectadas.

20. Colección de muestra
Envío
Debe existir conciencia del riesgo potencial
durante el transporte de material biológico no solo para
el personal sino que para el publico en general.
Regulación sobre el empaque, etiquetas y
documentación asociada al envío de material
biológico.
Entrenamiento a personal a cargo sugerido cada dos
años.

22. Colección de muestra
Manejo de documentos
Documento debe contener:
Detalles de la colecta
Fecha
Número de muestra
Tipo de muestra
Volumen
Información de envío/transporte
Información sobre la cadena de frio
Información de personal a cargo
Regulación de confidencialidad.
Sistema de código de barras/ sistemas de bases de datos
electrónicas.
Almacenamiento seguro de documentos.

23. Colección de muestra
Estricta adherencia a protocolos
Procedimientos operativos estándar (POEs).
Figura 2: Representación esquemática de procesamiento de muestras de sangre
coagulada y heparinizada .

24. Colección de muestra
Estricta adherencia a protocolos
Figura 3: Representación esquemática del procesamiento de células
exfoliativas de epitelio bucal y urinario.

25. Colección de muestra
Estricta adherencia a protocolos
Figura 4: Procesamiento de extracción de ADN/ARN a
partir de muestras de sangre .

26. Colección de muestra
Estricta adherencia a protocolos

27. Procesamiento de muestras
Dependiendo el origen de la muestra biológica colectada el
procesamiento puede permitir la obtención de una variedad de
bioespecímenes.
Distintos tipos de procesamientos.
Procesamiento efectivo permite la obtención de :
Extracción de gran cantidad de ADN
Almacenamiento de ARN de alta calidad
ADN de células bucales para genotipificación
Obtención de componente linfocitario
Preparación de placas metafásicas
Criopreservación de linfocitos para cultivo celular
Preparación de frotis de células exfoliativas bucales y urinarias

28. Procesamiento de muestras
El tipo de muestra a almacenar determina el tipo de buffer y
condiciones de almacenamiento determinadas.
Ej.: β - Mercaptoetanol para alícuotas de ARN
Determinar volumen de almacenamiento para evitar ciclos de
congelación/descongelación.

29. Procesamiento de muestras
Criopreservación de células aisladas recientemente
Sangre completa puede ser crio preservada en igual
proporción de suero fetal bovino y DMSO.
Criopreservación de componente linfocitario
en PBS/DMSO.
Almacenamiento en nitrógeno líquido (-196° C).

30. Procesamiento de muestras
Preparación de células para análisis citogenético
Células en interfase suelen ser necesarias la mayor parte
de las veces.
Ej.: Análisis de Micronúcleos
Metafases son necesarias para la visualización de
aberraciones cromosómicas, hibridación in situ, etc.
Cultivo Celular: Sangre completa o Linfocitos.
Mitógenos: Concavalina, PHA, Interleuquinas, etc.
Inhibidores de la mitosis: Colcemid, Colchicina, etc.

31. Procesamiento de muestras
Preparación de células exfoliativas de epitelio bucal y
urinario.
Las células pueden ser lavadas con bufferTris-HCL/EDTA
para realizar frotis celulares.
Frotis celulares pueden ser almacenados a -80 grados
Celsius y ser utilizados como recurso para la extracción de ADN.

32. Procesamiento de muestras
ADN y ARN de alta calidad
Factores que afectan la calidad de la extracción de
ácidos nucleicos:
Calidad de la muestra original
Calidad de la extracción y el método usado
Condiciones de almacenamiento
Compromiso de la integridad celular
Obtención de múltiples alícuotas
La estabilidad del ADN es mucho mayor que la del ARN.
Kit de extracción de ADN y ARN .
Método de extracción Fenol/Cloroformo de ADN .

33. Biobancos
Existe una necesidad ya que hay millones de muestras colectadas
para estudios epidemiológicos almacenadas
que luego no son reutilizadas.
Se necesita realizar adecuados procesamientos, almacenamientos,
etiquetamiento y un sistema de manejo de información de muestras
y sujetos es esencial.
El sistema electrónico de manejo de datos debe estar apoyado por
un sistema de código de barras eficiente y adecuado.

34. Biobancos
Características de un sistema de base de datos:
Flexibilidad ante diferentes protocolos de procesamiento
Apoyo a distintos niveles de usuarios de biobanco
Diseño amistoso para usuarios
Código de barras para reconocimiento automático
Sistema de ingreso de datos rápido y a prueba de errores
Impresión de etiquetas automatizado
Generación de respaldos semanales de la base de datos

35. Análisis de muestras
Tabla 2: Distintos tipos de análisis que pueden ser realizado a
partir de muestras especificas.
Dar valor a las muestras almacenadas disminuyendo la cantidad de
muestra empleada por análisis y maximizando su uso.