Este documento resume un estudio sobre la interacción entre el virus del dengue y la proteína ALIX en células humanas. Los resultados mostraron que la proteína NS3 del virus del dengue interacciona y se colocaliza con ALIX. Además, la eliminación de ALIX mediante ARNip redujo la producción viral pero no afectó la replicación del ARN viral. El estudio proporciona evidencia de que ALIX participa en la propagación viral pero no en la replicación.

1. Catalina Aguilar Arias
Third semester, Facultad de Medicina, Universidad Pontificia Bolivariana

2. Introduction DENGUE
Arthropod-borne viral
disease
390 million dengue
infections occur annually
The causative agent of dengue is
the positive sense, single stranded
RNA virus
It can be
asymptomatic
Non-structural proteins (NS1, NS2A,NS2B, NS3, NS4A, NS4B, and NS5)
NS3
Interacts with a number
of host cellular proteins,
NRBP and ALIX.
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3. Introduction
ALIX
Apoptosis Linked gene-2-Interacting protein X
Ø Protein also known as Program Cell Death 6 interacting Protein.
Ø Is an accessory protein in the endosomal sorting complexes required
for transport pathway, and it has been implicated in membrane
acquisition for a number of viruses.
ALIX Y DENV
q ALIX may therefore have an
unidentified role in the Dengue
Virus replication cycle.
q ALIX was up-regulated in the
cytosol of DENV infected human
endothelial cells.

4. Overall objective
Study the interaction between dengue virus and apoptosis linked gene-2-
interacting protein X (ALIX) for viral propagation

5. Materiales y
métodos
Co-inmunoprecipitación
FUNDAMENTO ¿PARA QUÉ?
v Se precipita el antígeno de
una proteína en una
solución utilizando un
anticuerpo que se une
específicamente a ella.
v Lisados celulares se
recogieron de células no
infectadas e infectadas con
DENV.
v Proteínas se separaron
mediante SDS-PAGE.
v Membranas se sondaron
con un anticuerpo anti
DENVNS3.
Para investigar la relación
entre DENV NS3 y ALIX.

6. Materiales y
métodos
Ensayo de inmunofluorescencia
• Se incubaron con un anticuerpo
policlonal contra el DENV NS3.
• Se contrastaron con DAPI antes
de montarlas con el reactivo
ProLong Gold Antifade.
Fundamento
• Ver la colocalización entre ALIX
y DENV NS3 utilizando los
coeficientes de correlación de
Pearson.
¿Para qué?

7. Materiales y
métodos
ARNip: construcción y transfección
Construcción
• Sitios de objetivo de ARNip se diseñaron basándose en la
secuencia completa de la secuencia de ARNm de ALIX
humano, utilizando el kit de construcción de ARNi
Silencer®.
Transfección
• Células se transfectaron de forma inversa con o sin
ARNsi usando Lipofectamine RNAiMAX.
• Se recogieron durante 5 días después de la transfección y
los ARN totales se aislaron utilizando Tri reactivo.
¿Para qué?
• Para poder examinar el nivel de expresión de ARNm de
ALIX mediante PCR en tiempo real, se necesitaba
realizar el proceso de construcción y transfección de
ARNip.

8. Materiales y
métodos
Transcripción inversa y PCR en tiempo real
Fundamento
• ARN extraídos de las
células se convirtieron en
ADNc utilizando la
transcriptasa inversa
ImProm-II ™.
• Se usó un µL de ADNc en la
reacción de PCR en tiempo
real.
• Se determinó la expresión
de actina para la
normalización.
¿Para qué?
Para determinar los umbrales
(CT) para la amplificación de
ALIX y los genes de actina de
cada reacción y poder analizar
la expresión relativa de ALIX.

9. Resultados: Interacción
entre ALIX y DENV-2 NS3
o Mostraron que NS3 estaba
coinmunoprecipitado con ALIX.
o Se observó un nivel más bajo de
ALIX precipitado en las células no
infectadas en comparación con las
células infectadas con DENV.
o Es posible que ALIX se haya
incrementado en la infección por
DENV.
.
.
.

10. Resultados: Colocalización
entre ALIX y DENV NS3
después de la infección
Los resultados (Fig. C) mostraron una
clara colocalización entre las dos
proteínas, mediante imagen confocal y
evaluación del coeficiente de
correlación de Pearson.
.
.
.

11. Resultados: ALIX participa en la
producción de DENV, pero no en la
replicación de ARN viral
.
.
.
Estos resultados confirmaron que
en las células en las que se había
eliminado de forma endógena
ALIX mediadas por el sistema
CRISPR-Cas9, no se afectó la
replicación DENV, sino solo la
producción viral.

12. Discussion
AUTHOR CONCEPT YES OR NOT
Zhai et al The tyrosine residue of the
late domain is the most
critical residue affecting ALIX
binding affinity and
specificity.
Pattanakitsakul et al There is an ALIX-LBPA
interaction in DENV protein
synthesis and replication:
pretreatment of cells with an
antibody against LBPA
delayed DENV E protein
synthesisand reduced viral
production
Khadka et al Down-expression of cellular
ALIX in the liver cell line
used had no effect on DENV
replication in a replicon assay
system

13. Conclusions
Knowing that the
dengue virus
requires interaction
with ALIX for the
viral propagation,
extra studies and
research would be
done to avoid
future cases of
dengue
1 With the
knowledge of this
study, analyzes
could be done to
reduce the public
health problems
caused by the
dengue virus
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