Esta presentación surge de una actividad del curso "Diseño de materiales educativos digitales" brindado por el Citep (UBA)

1. ESTUDIOS DE LA INMUNIDAD
CELULAR QUE UTILIZAN PBMCs
INMUNOLOGÍA (BIOQUÍMICA)
BIOQ. AGUSTINA DANIELA SOTELO
AÑO 2019

2. ¿DÓNDE ESTAMOS?
Sistema
Inmune
Inmunidad
Humoral
Anticuerpos
Interacción
secundaria
(Aglutinación,
Precipitación)
Interacción
Primaria
(ELISA, IFI,
RIA)
ComplementoCitoquinas
Inmunidad
Celular
Linfocitos T y B
Fagocitos
(Macrófagos y
neutrófilos)
Células NK

3. ¿CÓMO SE EVALÚA LA INMUNIDAD CELULAR?
Pruebas funcionales Pruebas no funcionales
In vivoIn vitro
In vitro
Funcionalidad
• Activación celular
• Proliferación
• Función efectora
• Producción de sustancias
inmunoreguladoras (citoquinas)
• Expresión de receptores
Caracterización/ Número celular
• Detección de tipos celulares
• Caracterización fenotípica
• Evaluación número total de linfocitos
• Relaciones LT/LB, LT CD4+/ CD8+

4. Pruebas
funcionales
Pruebas no
funcionales
In vivo
In vitro
In vitro
Pruebas de Hipersensibilidad Cutánea Tardía (Intradermorreacción)
Sensibilidad por Contacto
Citometría de Flujo
IFI
Ensayos de Proliferación Celular
Pruebas de citotoxicidad mediada por
Por mitógenos
Por Ags de CMH= CML
LT (CMC)
Ac (ADCC)
UTILIZAN PBMCs!!

5. Animales (ratones)  ORGANOS LINFOIDES 2rios (bazo – ganglios)
Humanos  SANGRE anticoagulada (GR interfieren)
Recordar: para realizar pruebas funcionales se
requiere trabajar con CULTIVOS CELULARES
Mantener la ESTERILIDAD!!!!
NO SANGRE  escasa
volemia
¿CUÁL ES NUESTRO MATERIAL
DE PARTIDA?
https://drive.google.com/open?id=1tvaG27WoxHjcHfxm2OxCWvPI7dPzE-Mo
¿Recordás cómo obteníamos la muestra de sangre anticoagulada?:

6. GRADIENTE DE FICOLL- HYPAQUE
Plasma y plaquetas
MONONUCLEARES
(70-90%)
LINFOCITOS
MONOCITOS
Ficoll-Hypaque
Polimorfonucleares (eosinófilos, neutrófilos)
Glóbulos rojos
Muestra de
sangre diluida
Ficoll-
Hypaque
Centrifugación
400g 30min
Temp. Amb.
Hypaque: sustancia que confiere una δ= 1.078 g/ml
AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES (PBMCs) A PARTIR DE SANGRE
PERIFÉRICA

7. In vitro
Ensayos de Proliferación Celular
Pruebas de citotoxicidad mediada por
Por mitógenos
Por Ags de CMH= CML
LT (CMC)
Ac (ADCC)
Pruebas funcionales
Se utilizan para evaluar inmunidad celular en pacientes con:
•Inmunodeficiencias
•Autoinmunidad
•Enfermedades Infecciosas
•Cáncer

8. Proliferació
n celular
CFSE
Observación
microscópica
de blastos
Incorporación
de BrdU
Incorporación
de 3H-
Timidina
¿Cómo se puede evaluar la proliferación de
las PBMCs?

9. PROLIFERACIÓN CELULAR
Incorporación de
3H- timidina

10. Incorporación de BrdU
BrdU: Homólogo sintético de la timidina
• Se incorpora en el ADN de las células en fase S del ciclo celular
PROLIFERACIÓN CELULAR

11. CSFE
(Fluorescencia/cel)
(Célula con la
sonda)
Es una molécula fluorescente que no puede atravesar la membrana
plasmática, quedando retenida en el interior de la célula. Se une a proteínas
intracelulares y de membrana, que se reparte por igual entre las células hijas.
PROLIFERACIÓN CELULAR

12. PROLIFERACIÓN CELULAR POR MITÓGENOS
Mitógeno: Sustancia que estimula la proliferación inespecífica de los linfocitos. No
requieren que el individuo esté previamente sensibilizado.
Evaluación de
la respuesta
Tiempo de estimulación/cultivo: 2-4 días

13. PROLIFERACIÓN CELULAR POR Ags DE
CMH
Fundamento: Proliferación celular por reconocimiento de las moléculas CMH II
como extrañas (Ag alogénicos) presentes en otros linfocitos o monocitos
Cultivo mixto linfocitario (CML)
Utilidad: Evaluación de la activación de LT
Evaluación de histocompatibilidad en trasplantes (principalmente de MO)
¿Vemos un ejemplo?
https://www.youtube.com/watch?v=FD2xKs6jyjY

14. Células a evaluar:
• LT CD4+
(del R y del D)
Ag estimulador:
• CMH clase II
(en CPA del D y
del R)
Tanto las células del
donante como del
receptor actúan tanto
como respondedoras
y estimuladoras
Cultivo mixto linfocitario (CML)

15. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR LT (CMC)
Células a evaluar:
LT CD8+
Incubación 4hs
Por interacción entre TCR del LTc con péptidos presentados en contexto de CMH I (Ag
especifica) o por interacción con CMH I del donante (Transplantes): lisis celular
Ag estimulador:
CMH clase I
Utilidad: Evaluación de respuesta inmune citotóxica contra tumores, trasplantes, virus.

16. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS (ADCC)
La célula efectora debe tener receptores para Fc
(generalmente RFcγ)  NK, monocitos, granulocitos
Se determina % de lisis de las célula blanco
(marcadas con 51Cr)
Se hace un ensayo igual al de
citotoxicidad mediado por células
pero SIN SENSIBILIZACION
PREVIA de células efectoras y con
las células blanco marcadas con
Cr y sensibilizadas con Ac.
Evalúa la capacidad de las células efectoras inmunocompetentes o la actividad
de un anticuerpo específico para mediar ADCC.
Utilidad:
• Evaluación funcional en pacientes con cáncer en tratamiento inmunológico.
• Evaluación de anticuerpos contra aloantígenos, células tumorales o virus en sueros de
pacientes que recibirán un trasplante, que cursan rechazo de injerto o infección viral.
51Cr

17.  BIBLOGRAFÍA
• Recomendaciones de la sociedad brasileña de patología clínica y medicina laboratorial para la
extracción de sangre venosa (2010)
http://www.sbpc.org.br/upload/conteudo/320100928153008.pdf
• Aislamiento de células mononucleares, extracción de ADN y amplificación de genes (Cuellar
Nenclares et al)
http://acmor.org.mx/cuam/2008/203adn.pdf
• Aislamiento de células mononucleares humanas por gradiente de ficoll (2008)
http://www.genomica.uaslp.mx/protocolos/cell_ficollprep.pdf
• Aislamiento más rápido de PBMC usando ficoll-paque® plus en las centrífugas de sobremesa
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