Tecnicas primarias, ELISA

1. Técnicas Inmunoenzimáticas
Determinación de isotipo de Ac monoclonal mediante la técnica de
ELISA
Inmunología (Bioquímica)
Curso de Capacitación y Formación Docente
Dra. Andrea Cecilia Parrado
-2019-

2. INDICE TEMÁTICO
1.Introducción…………………….……………………………………..………….………………..…….1
2.Anticuerpo Monoclonal: ¿qué es y cómo se obtiene? ...................................1
2.1. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales ……………………………..3
3.Técnicas primarias ..........................................................................................3
3.1. Técnicas inmunoenzimaticas ..............................................................4
4.Determinación de isotipo. Diseño experimental ............................................7
Ejemplos………………………………………………………………………………………………………..8
Conclusión …………………………………………………………………………………………………….9
Bibliografía ………………………………………………………………………………………………….10

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1. Introducción
Frecuentemente es necesario conocer/determinar la clase de anticuerpos monoclonales
producidos por un animal o por un hibridoma, así como también caracterizar anticuerpos
presentes en el suero de pacientes que cursan una condición inflamatoria o neoplásica. Para los
hibridomas, es crítico caracterizar a los anticuerpos monoclonales determinando la clase,
comúnmente llamada isotipo, dado que esta establecerá la estrategia para su purificación. Esta
caracterización revelará las características biológicas de los anticuerpos, como la capacidad de
unirse a complemento, la proteína A o G, así como la vida media sérica (Hombeck, P, et al, 2017).
Existen varios fabricantes que ofrecen kits comerciales que permiten la determinación de la clase
(IgM, IgG, IgA, IgE, o IgG) o subclases (IgA1 o IgA2, o IgG1, 2, 3, o 4 para humanos; e IgG1, 2a, 2b,
3 para ratón) de inmunoglobulinas de cadena pesada o si las cadenas livianas son κ o λ. Los
diferentes métodos para la determinación de clases consideran a las moléculas de anticuerpos o
inmunoglobulinas como antígenos y utilizan anticuerpos anti-inmunoglogublinas y agentes
sensibles y específicos para la detección. En esta unidad se describirá el enzimoinmunoensayo
como método para caracterizar anticuerpos monoclonales.
Pero antes es necesario conocer a los actores de esta reacción, los anticuerpos
monoclonales, que luego serán utilizados para el desarrollo de otros kits o algún tipo de
marcación específica de alguna molécula de interés.
2. Anticuerpo Monoclonal: ¿qué es y cómo se obtiene?
Los anticuerpos (Acs) son glicoproteínas séricas constituidas en su unidad fundamental de
inmunoglobulina (Ig) por dos cadenas pesadas y dos livianas. La respuesta inmune humoral se
establece a partir de la activación de múltiples linfocitos B (LB) específicos para un antígeno (Ag)
por lo que resulta una respuesta policlonal. Por otro lado, los anticuerpos monoclonales
(Monoclonal antibodies, (mAbs por sus siglas en inglés), son anticuerpos producidos por un único

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clon de linfocitos B (LB). Köhler y Milstein (1975) descubrieron
que estas células podrían ser inmortalizadas por la fusión con
células de mieloma. Como resultado de la hibridización se
obtienen células hibridomas que son capaces de producir
potencialmente un número ilimitado de anticuerpos. Por el
desarrollo de esta metodología les otorgaron en 1984 el premio
Nobel de Medicina. Desde la publicación de este desarrollo los MAbs se convirtieron en
herramientas esenciales tanto en investigación básica, como en la bioquímica clínica
(permitiendo el desarrollo de métodos para diagnóstico más específicos) y también como pilares
para el desarrollo de nuevos tratamientos médicos. El desarrollo de anticuerpos monoclonales
requiere las siguientes fases sucesivas:
1- Plan de inmunización para
la obtención de linfocitos B
específicos para el antígeno
2- Fusión de los LB con
células de mieloma para
formar los hibridomas
3- Clonación y
selección de células
especificas por
dilución limite o por
aislamiento en agar
blando
4- Producción a gran escala
de la producción de MAbs
5-Purificación
de los MAbs
César Milstein (1927-2002)
Figura 1: Pasos para la producción de anticuerpos monoclonales (MAbs) específicos para un determinado
antígeno. Para profundizar en el tema ir al siguiente link:
https://www.slideshare.net/CeciliaParrado/caracterizacion-de-anticuerpos

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2.1. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales:
La homogeneidad y la monoespecificidad de los Mabs los convierte en reactivos y
herramientas de elección para varios propósitos:
 Purificación de proteínas (Ej. cromatografías de afinidad)
 Identificación y aislamiento de poblaciones celulares
 Aplicaciones diagnósticas: enzimoinmunoanálisis (EIA), radioinmunoanálisis, citometría
de flujo, entre otras técnicas.
 De combinar la tecnología de Mabs con la ingeniería genética se han producido por
ejemplo anticuerpos humanizados y quiméricos que están revolucionando los
tratamientos de: cáncer, enfermedades autoinmunes, trasplantes, enfermedades
infecciosas y alergias.
¿Qué sucede con la producción de anticuerpos monoclonales en Argentina?
¿Lo averiguamos?
https://youtu.be/FU9mxBT1dL0
3. Técnicas de Interacción Primaria
La reacción inmunológica depende de la complementariedad que pueda existir entre un
antígeno y un anticuerpo y constituye una interacción típica entre macromoléculas. Las técnicas
de interacción primaria son mucho más sensibles que las de interacción secundaria y permiten la
identificación de Ags o Acs en situaciones donde las últimas no son útiles debido a que están
condicionadas por las concentraciones y las características fisicoquímicas de ambos

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inmunorreactantes, así como también por las propiedades del medio de reacción. A diferencia
de las técnicas secundarias, se pueden detectar Ags y Acs monovalentes o polivalentes, pero al
ser interacciones simples se caracterizan por no ser visualizables.
Existen tres tipos de técnicas que se basan en la interacción primaria; los
enzimoinmunoensayos (EIA), los radioinmunoensayos (RIA) y las técnicas de
inmunofluorescencia (IF). Las señales detectadas serán colorimétricas, radioactivas o
fluorescentes, respectivamente, y se deben a un reactivo denominado conjugado, que consta de
un Ag o un Ac unido a una enzima, un fluorocromo o un radioisótopo (en cuyo caso particular lo
denominamos trazador o radioligando). En este apartado nos centraremos en los
enzimoinmunoensayos.
3.1. Técnicas inmunoenzimáticas
El fundamento de los enzimoinmunoensayos es evidenciar la interacción Ag-Ac utilizando
alguno de los inmunorreactantes marcados con una enzima capaz de desarrollar una reacción
colorimétrica. Las enzimas utilizadas con mayor frecuencia para el marcado es la peroxidasa y
fosfatasa alcalina. Estas técnicas se basan en dos fenómenos biológicos importantes como ser:
 Elevada especificidad de los anticuerpos (Ac)
 Alta actividad de algunas enzimas usadas, lo que permite la amplificación de la señal
generada por la muestra.
Además, independientemente de los esquemas experimentales empleados, los EIA
comprenden dos etapas generales:
1- la reacción de un inmunorreactante con un Ag o Ac;
2- la detección de ese inmunorreactante mediante la utilización de un conjugado
enzimático
Los enzimoinmunoensayos pueden clasificarse según la separación de fases en
homogéneos y heterogéneos; y su vez, en competitivos y no competitivos.
Los EIA homogéneos se caracterizan por realizarse en fase líquida donde el Ag a determinar
o utilizado debe ser una molécula pequeña (hapteno, hormonas no peptídicas, etc). Éste se une

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covalentemente a una enzima, cerca del sitio activo, de manera tal de no impedir la actividad
enzimática. Dicha actividad se verá alterada por la unión de un Ac específico al Ag. Aquí, la
visualización de actividad enzimática indica que no hay reacción Ag-Ac. Este sistema puede ser
utilizado para cuantificar ciertos Ags con las características mencionadas, por competencia con
el conjugado. En este ensayo no es necesario ningún paso de separación, dado que la actividad
enzimática está directamente afectada por la unión del Ac.
En el caso de los EIA heterogéneos, también llamados ELISA (enzyme-
linked immunosorbent assay), el conjugado puede ser tanto el Ag
como el Ac y la preparación del mismo es mucho más sencilla. La
conjugación puede ser química o inmunológica. Las enzimas más
usadas en este tipo de técnicas son la peroxidasa de rábano (HRPO o
horseradish peroxidase) y la fosfatasa alcalina (FA). En el primer caso el sustrato es el peróxido
de hidrógeno, que por acción de HRPO dismuta según: 2 H2O2 2H2O + O2; el oxígeno generado
actúa luego sobre un cromógeno como el OPD, oxidándolo y generando un color cuantificable en
un espectrofotómetro. En el caso de la FA, los sustratos son los ésteres de fosfato, siendo el más
usado el p-NPP (para nitro fenilfosfato).
Los EIA heterogéneos son denominados también ELISA de fase sólida, debido a que en
estos ensayos se cuenta con una fase sólida en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes.
Esto permite la remoción de todo aquello que no interaccione con la molécula inmovilizada con
un simple lavado (igual que en IRMA). La inmovilización, también llamada sensibilización, es la
unión del Ag o Ac a la fase sólida.
Este tipo de técnicas se subdividen a su vez, en ensayos competitivos y no competitivos.
En los ELISA competitivos (o de modulación) se hacen competir Ags por un Ac o viceversa, en
ambos casos la respuesta es inversamente proporcional a la concentración de Ag en la muestra.
En el caso de los ELISA no competitivos (o de amplificación), éstos pueden ser cuantitativos,
semicuantitativos y cualitativos y la señal será siempre proporcional a la concentración de la

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molécula incógnita. Las reacciones cualitativas se caracterizan por determinar la presencia de Acs
específicos o Ags en una muestra incógnita. En el caso de las cuantitativas se determina la
concentración de Ags específicos, mientras que en las semicuantitativas se obtiene un título de
Acs específicos en una muestra incógnita.
Existen distintos tipos de diseños experimentales que pueden plantearse según el
objetivo:
Figura 2: Diagrama de los esquemas más comunes de ELISA. Imagen extraída de Thermo Fisher
Scientific. Para ver cada uno de los esquemas se puede visitar:
https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-science/protein-biology/protein-biology-
learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-
elisa.html
En todos los ensayos en fase sólida, independientemente de las estrategias utilizadas,
se pueden distinguir 3 etapas:
1- Inmovilización del inmunorreactante (Ac o Ag) en la fase sólida;
2- Incubación con la muestra de modo que ésta reaccione con el inmunorreactante
inmovilizado;
3- Amplificación o modulación por medio de la utilización de un conjugado enzimático.

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4. Determinación de isotipo. Diseño experimental
Como se mencionó anteriormente los MAbs resultan ser una herramienta poderosa para
el diagnóstico de laboratorio y un instrumento cada vez más utilizado en el tratamiento de
diversas enfermedades. Su alta especificidad permite el abordaje de dianas muy precisas que
pueden determinar cambios celulares muy variados; además, dependiendo de la región
constante de los anticuerpos pueden diseñarse para facilitar distintos tipos de respuestas
efectoras. El empleo de anticuerpos humanizados y humanos ha mejorado notablemente su
tolerancia clínica abriendo un gran abanico de posibles aplicaciones en medicina (García Merino
A, 2011). Es por esa razón que el screening de los hibridomas es uno de los pasos más
importantes durante el desarrollo de los mismos para la producción de los MAbs, con el fin de
asegurar la selección de aquellos clones que resulten más productivos y específicos. Como
parte de esos screenings, se caracteriza el isotipo de anticuerpos que implica la determinación
de la clase (IgG, IgM, IgA) así como de la subclase (IgG1, IgG2, etc) del anticuerpo monoclonal.
Una de las metodologías utilizadas para determinar el isotipo de los MAbs es el ELISA de
captura o sándwich (pasos generales en
https://youtu.be/_8r5XVmKfOc). Esto requiere el uso de anticuerpos
anti-Ig específico de las diferentes clases y subclases de los MAbs
presentes en la muestra. Existen varias empresas que
comercializan kits que permiten determinar el isotipo de
anticuerpos, por ejemplo: BD Biosciences, Roche Applied Science,
Sigma-Aldrich, Southern Biotech, Thermo Scientific Pierce. Estos
kits de ELISA suelen consistir en recubrir (o también llamado
sensibilizar) una placa de poliestireno con el anticuerpo específico
(Ac captura o primario) que capturará a los MAbs de determinado
isotipo presente en la muestra. Cada pocillo incluirá un anticuerpo
específico para cada una de las clases/subclases de Igs de la
especie correspondientes (ratón o rata). Posteriormente, la adición
de un Ac secundario de detección acoplado a un enzima que permitirá el revelado de la reacción
(Weis-Garcia, F y R.H. Carnahan, RH, 2017).
Imagen obtenida de
https://www.rndsystems.com

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A continuación, se incluye un ejemplo de protocolo para la determinación de
Ig de ratón mediante la técnica de ELISA de captura (Cold Spring Harb Protoc;
doi:10.1101/pdb.prot093831).
Reactivos:
 Ac de captura: Ac específico de cabra anti-Ig de ratón (no debe cruzar con los Ac bovinos
presentes en el medio de cultivo que contienen suero fetal bovino)
 Ac de detección: Ac de cabra conjugado a peroxidasa anti-IgG (L  ó ) de ratón
 Buffer de unión: 0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.0
 Buffer de bloqueo: Albúmina bovina sérica (BSA, 1%) en
PBS1X -Tween 20 (0.1%)
 Buffer de lavado: PBS 1X-Tween 20 (0.1%)
 Control positivo: Acs específicos de isotipo
 H2SO4 (2M)
Procedimiento:
1- Sensibilizar con 50µl de Ac de captura anti- IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, or IgM
(1:1000) de ratón en buffer carbonato. Incubación de la placa durante ON a 4°C, 1 h a 37°C o 4
h a 37°C.
2- Remover el líquido y lavar la placa 3 veces con buffer de lavado
3- Agregar 300 µl de buffer de bloqueo. Incubar 1-4 h a temperatura ambiente
4- Remover el líquido y lavar la placa 3 veces con buffer de lavado
5- Agregar 50µl de la muestra a cada pocillo, y el control positivo o buffer carbonato (control
basa) a los pocillos correspondientes. Incubar 1-2 horas a temperatura ambiente
6- Remover el líquido y lavar la placa 3 veces con buffer de lavado
7- Agregar 50µl de Ac de detección anti-L de ratón. Incubar 30-60 minutos a temperatura
ambiente
8- Remover el líquido y lavar 3 veces con buffer de lavado
Ejemplo
s

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9- Agregar TMB (sustrato) e incubar durante 2-15 minutos a temperatura ambiente
10- Agregar H2SO4 (2M) para detener el desarrollo del color
11- Leer en un lector de ELISA a 540nm.
Los EIA o ELISA permiten la detección de distintos tipos de moléculas biológicas a
muy bajas concentraciones y cantidades. Por lo tanto, son considerados importantes
herramientas para la investigación científica básica y aplicada, así como también para el
diagnóstico clínico.
CONCLUSIÓN

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Bibliografía
 Hornbeck P, Fleisher TA, Papadopoulos NM. Determinación de isotipos de
anticuerpos. Curr Protoc Immunol. 2017 2 de febrero; 116: 2.2.1-2.2.7. doi: 10.1002
/ cpim.19.
 Margni y col. 5° Ed., Inmunología e Inmunoquímica. 1996. Editorial Médica
Panamericana
 Edward A. Greenfield. Antibodies A Laboratory Manual, Second edition, 2013
 Garcia Merino A, 2011
 Weis-Garcia, F y R.H. Carnahan, RH, Cold Spring Harb Protoc;
doi:10.1101/pdb.prot093831