Se describen métodos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales, Utilidad de adyuvantes y carriers para producir una respuesta de producción de anticuerpos

1. Alfredo Prieto Martín
Cuestionario on line en
https://docs.google.com/forms/d/18-
ysk1RqfSfiiHa-
5yQry3nsaNv_54i7_RaWyM51ZIE/viewform?usp=sen
d_form

2. 1. Introducción estructura de la molécula de anticuerpo
2. Inmunización. Inducción de respuesta inmune (Anticuerpos, Abs.) frente a un
antígeno o patógeno. Mediante estimulación con Antígenos (ags). Moléculas
del patógeno
 Adyuvantes, adyuvante de Freund. Asocian físicamente Ag con estímulos no ag específicos
 Carriers para la inmunización con moléculas pequeñas (haptenos). Asocian químicamente
hapteno a molécula mayor.
3. Producción y uso de anticuerpos policlonales (sueros anti-X muchos clones ) y
monoclonales (por único clon inmortalizado hibridoma).
 Tecnología de hibridomas.
4. Inmunoterapia.
 Problema para la inmunoterapia la inmunogenicidad del anticuerpo y su solución:
humanización del anticuerpo.
5. Inmunodiagnóstico (reactivo estandarizado, Ab. monoclonal lo resuelve).
 Inmunohistoquímica
 Inmunofluorescencia

3. ISOTIPOS DE Ab ESTRUCTURA DEL
MONÓMERO de Ab
Genes
El anticuerpo es un receptor proteico de alta
afinidad química por el antígeno 10
6
a 10
11
secretado por las células B
Aunque afinidad muy es alta, la unión es reversible
Depende de pH esto implica que…
Ag.
*
2H +2L

4.  Es la estimulación deliberada de una respuesta inmune frente a un antígeno.
 Se inyecta antígeno acompañado de un adyuvante que forma partículas que son
confundidas con microorganismos por las células fagocíticas. (células dendríticas)
 El adyuvante estimula, la fagocitosis, activa la célula fagocítica que presentará el
antígeno al linfocito Th que ayuda a la respuesta de células B antígeno especificas.
 DC/Mf Th1 Bcell IgG1
 El resultado final de esta reacción celular en cadena es la producción de anticuerpos
con alta afinidad y especificidad por el antígeno
 Ag. + Adyuvante = estímulo para producción de anticuerpos

5. 1. Obtención de antisueros (anticuerpos policlonales)
en animales inmunizados.
2. Aislamiento de clones productores.
Inmortalización. Síntesis de anticuerpos
monoclonales (mAb).
3. Reducción de la inmunogenicidad de los mAb.
Síntesis de anticuerpos monoclonales, quiméricos
humanizados y humanos

6.  La inmunización puede hacerse en dos contextos
1. Para vacunar al individuo inmunizado (en seres humanos o animales a los
que queremos proteger de agentes infecciosos, vacunación)
2. Para obtener anticuerpos o células productoras de ellos a partir del
individuo inmunizado
 Antisueros mezcla policlonal de anticuerpos
 ejemplos sueros antitoxina diftérica o tetánica
 Clones de células B específicas que serán nuestra «fábrica de anticuerpos
monoclonales»

7.  Uso como reactivo experimental o diagnóstico
 En terapia, antisueros antitetánicos,antidiftéricos.
• VENTAJAS: rápido y de bajo
coste
• INCONVENIENTES: Reproducibilidad
limitada, cantidad limitada de Ab.Extraemos sangre y obtenemos suero del
animal inmunizado
Inyección en la dermis produce
una inmunización optima
¿Cuáles son los problemas de este reactivo?
Contiene una mezcla policlonal de
anticuerpos frente al antígeno
La cantidad es limitada
No es reproducible
+ adyuvante

8.  Los adyuvantes potencian la respuesta frente a los antígenos a los
que acompañan.
 El Adyuvante secuestra el material antigénico y forma partículas
que lo llevan a los fagocitos a los que estimula para que inicien la
activación de células T antígeno-específicas.
 Se mezcla 1. solución acuosa con antígeno proteico con 2 un agente
que incorpora el antígeno en micropartículas fagocitables:
◦ Emulsión de aceite mineral (Freund)
◦ Partículas de gel de hidróxido de aluminio
◦ Soluciones coloidales ISCOM
 Se incorporan componentes bacterianos que estimulan al macrófago
(receptores PAMP) para que presente antígeno y coestimule a los
linfocitos T que lo reconozcan. Estos cooperarán con células B
productoras de anticuerpos específicos

9.  Los carriers (transportadores) son sustancias a las que
unimos químicamente la molécula antigénica para que
sea más inmunogénica.
 Llamamos hapteno a una pequeña molécula que sólo
puede provocar la respuesta inmune cuando esta unida a
otra mayor como una proteína ej. Hemocianina de
moluscos (KLH).
 Debe preservarse la estructura tridimensional de la
molécula pequeña.
 De esta manera podemos inducir anticuerpos específicos
frente a una molécula pequeña.
 Una vez formados son capaces de unirse a ella cuando
esta sola
 ¿Para qué puede servir?
 Test and therapy Breaking bad habits and aditions
cocaine

10.  Calmette y Guerin desarrollaron una cepa atenuada mediante
cultivo in vitro de M. bovis llamada Baccillus CalmetteGuerin
(BCG) que se usa como adyuvante en inmunización y como
vacuna frente a la tuberculosis.
 Los Glicolípidos de Mycobaterium son reconocidos por el SI innato y el
Mycobacterium es un buen adyuvante en inmunización
(Adyuvante completo de Freund aceite/agua + BCG)
 Para preparar el adyuvante completo de Freund se añade BCG al
aceite mineral (parafina)

11. Generador de
emulsiones
 primero dosis inicial
sensibilización con adyuvante
completo (CFA),
 después dosis de recuerdo con
adyuvante incompleto (IFA sin
BCG) para evitar producir una
reacción de hipersensibilidad
 Su uso como adyuvante esta
prohibido en humanos por las
autoridades reguladoras pues
produce efectos tóxicos (DHT).

12. Micobacteria microareófila principal
causante de la tuberculosis bovina.
Relacionada con Mycobacterium
tuberculosis, puede llegar a causar
tuberculosis en humanos, principalmente
por el consumo de leche sin pasteurizar.
Con cepas atenuadas de
esta bacteria (BCG) se
elabora la vacuna de la
tuberculosis, la cual fue
elaborada por primera vez
en 1921 en el Instituto
Pasteur.
Bacilo de Calmette-GuérinMycobacterium bovis /
BCG
Es eficaz para prevenir
infecciones fatales en niños,
pero no previene la
tuberculosis pulmonar en
adultos

13.  Cepa atenuada de M. bovis llamada Baccillus
Calmette-Guerin (BCG) que es utilizada como una
vacuna viable:
◦ Previene la tuberculosis miliar en niños, diseminación
mortal que produce innumerables nódulos en pulmones y
otros tejidos (por diseminación hematógena). Bajó la
mortalidad por tuberculosis en niños desde 25% al 1,8%
◦ Problema: Sin embargo, no protege de modo completo
contra la tuberculosis pulmonar en los adultos
◦ BCG tiene muchas diferencias antigénicas con la M.
tuberculosi (perdida de 100 genes 2,5% genoma). Le falta
proteína de virulencia ESAT-6
◦ La inmunidad cruzada que proporciona es imcompleta

14. 1. Vacunas vivas
◦ A partir de M. tuberculosi atenuados a los que se les
han desactivado genes de virulencia
◦ A partir de M. bovis recombinantes al que se le añaden
genes perdidos de la cepa original
2. Vacunas de subunidades
◦ Antígenos seleccionados y adyuvantes
◦ Introducción de genes en un virus atenuado

15.  Modelo
experimental de
artritis
 Inyección de CFA
con colágeno
 También puede
inducirse con Ab
anti colágeno
 En este modelo podemos testar el
efecto de posibles tratamientos para
reducir la inflamación articular

16. Emulsiones
y geles de aluminio
Adyuvantes para inmunización
AddaVax™ Squalene-Oil-in-water Th1/Th2 response balanced
Alhydrogel®
adjuvant 2%
ALUM
Gel de hidróxido de aluminio respuesta de anticuerpos
Aluminium hydroxide gel Th2 Response
CFA
Complete Freund’s Adjuvant paraffin oil in water
Mycobacterium Ligandos para TLR2 TLR4 TLR9 y
trehalose dimycolate that stimulates Mincle R
(Macrophague inducible C-lectin Receptor) reconoce
azucares bacterianos
Th1 response IFNg IgG Mf first immunization (DTH)
IFA Incomplete Freund's adjuvant Th2 response recall
Quil-A®
adjuvant
Saponin vaccine adjuvant. Combined with cholesterol
and phospholipids to form ISCOMs (immunstimulatory
complexes), can activate both the cell-mediated and
the antibody-mediated immune responses

17. Ligandos que estimulan receptores de reconocimiento de patrones (PRR)
3’3’-cGAMP VacciGrade™
Dinucleotido ciclico segndo mensajero bacteriano
STING (STimulator of Interferon Genes ) ligand - Cyclic [G(3’,5’)pA(3’,5’)p]
2’3’-cGAMP VacciGrade™ STING ligand - Cyclic [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]
2’2’-cGAMP VacciGrade™ STING ligand - Cyclic [G(2’,5’)pA(2’,5’)p]
c-di-AMP VacciGrade™ STING ligand - CDS agonist - Cyclic diadenylate monophosphate Th1 / Th2 response
c-di-GMP VacciGrade™ STING ligand - CDS agonist - Cyclic diguanylate monophosphate Th1 / Th2 response
Chitosan VacciGrade™ NLRP3 inflammasome inducer - Deacetylated derivative of chitin Th1/Th2 response
Flagellin FliC VacciGrade™ TLR5 Agonist - Recombinant flagellin Th1/Th2 response
Gardiquimod VacciGrade™ TLR7 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 response
Imiquimod VacciGrade™ TLR7 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 response
LPS-EB VacciGrade™ Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 strain - TLR4-based adjuvant
MPLA-SM VacciGrade™ TLR4 agonist - Monophosphoryl lipid A Th1 response
MPLA Synthetic VacciGrade™ TLR4 agonist - Synthetic monophosphoryl lipid A Th1 response
N-Glycolyl-MDP VacciGrade™ NOD2 Agonist - N-glycolylated muramyldipeptide Th1 response
ODN 1585 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class A (murine) Th1 response
ODN 1826 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class B (murine) Th1 response
ODN 2006 Vaccigrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class B (human) Th1 response
ODN 2395 VacciGrade™ TLR9 agonist - CpG ODN, class C (human/mouse) Th1 response
Pam3CSK4 VacciGrade™ TLR1/2 agonist - Synthetic triacylated lipoprotein Th1 response
Poly(I:C) (HMW) VacciGrade™ TLR3 agonist - Polyinosine-polycytidylic acid Th1 response
R848 VacciGrade™ TLR7/8 agonist - Imidazoquinoline compound Th1 response
TDB VacciGrade™ Mincle agonist - Synthetic analog of the cord factor Th1 response
Mincle agonist - Synthetic analog of the cord factor (trehalose dimycolate) formulated

18. Clonamos y seleccionamos
G Kohler
C Milstein
1. 2.
3.

19. - PROTEÍNA
- PLÁSMIDO
- CÉLULAS
Inmunización
-3/4 inóculos Ag
-ADYUVANTES Y
CARRIERS.
CEPA: BALB/c, Y3
-CLONACIÓN
1DILUCIÓN
2 AGAR
3Sorting
Esplenocito resistente a HAT
Aporta enzima
HXGPRT
Inmortalizadas
pero deficientes en
enzima HXGPRT
Sensibles a HAT
Aportan
telomerasas que
regeneran los
telómeros de los
cromosomas de
las células
híbridas
Hibridoma
histocompatible
Medio
selectivo
HAT
Hipoxantina
Aminopterina
Timidina
Híbridos

20. HGPRT- HGPRT-/HGPRT+ HGPRT+

21.  Comprueban que el fármaco es seguro para
su uso en humanos
 Comprueban sus efectos beneficiosos sobre
la evolución de la enfermedad.