determinacion de isotipo de anticuerpos mediante ELISA

1. TECNICAS
INMUNOENZIMATICAS
Determinación de isotipo de Ac monoclonal mediante la técnica
de ELISA
Inmunología (Bioquímica) 2019
Dra. Andrea Cecilia Parrado

2. ¿Qué es un Anticuerpo Monoclonal?
• Un anticuerpo monoclonal (monoclonal
Antibody; mAb en inglés) es un
anticuerpo que proviene de un único
clon (LB) productor de anticuerpos con
características determinadas.
• Constituyen una población homogénea
y reconocen un único epítope.

3. Un poco de historia....
Premio Nobel en Fisiología y Medicina de 1984:
“Por el desarrollo de la técnica de
hibridomas para la producción de
anticuerpos monoclonales”.
Nature, Vol. 256 August 7 1975
Milstein (izquierda) y Kölher (derecha), creadores de la
técnica de hibridización somática para la generación de
anticuerpos monoclonales

4. ¿Cómo se producen los Anticuerpos Monoclonales?
1- Plan de inmunización para
la obtención de linfocitos B
específicos para el antígeno
2- Fusión de los LB con
células de mieloma para
formar los hibridomas
4- Producción a gran escala de
la producción de mAbs
3- Clonación y selección
de células especificas
por dilución limite o por
aislamiento en agar
blando5- Purificación
de los mAbs
In vitro
In vivo

5. Aplicaciones
• Purificación de proteínas
• Identificación y aislamientos de poblaciones celulares
• Como REACTIVO en técnicas de interacción primaria
Diagnósticas
• Terapias oncológicas conjugados a citotoxinas
• Terapia anti-rechazo de transplantes y enfermedades
autoinmunes
Terapéuticas
PERO.....antes de usarlas como herramientas hay que tener en cuenta..

6. •Isotipo: Inmunoprecipitaciónen gel, ELISA
• Epítope reconocido: ELISAs, inmunobloto Western blot
Nativo o lineal, repetido, compartido con otras proteínas o
reconocidos por otros monoclonales, etc.
• Afinidad: estimación por ELISA/RIA, de ser posible
Caracterización

7. Técnicas de interacción primaria
Es la unión EPITOPE - PARATOPE
¿Cómo se puede evidenciar la interacción primaria?
Enzimoinmunoensayos
(EIA)
Inmunofluorescencia
(IF)
Radioinmunoanálisis
(RIA)
Enzima que cataliza una
reacción enzimática
Sustancias fluorescentes
(fluorocromos)
Sustancias radioactivas
(radionucleídos)
Unidos a uno de los dos inmunoreactantes (Ac o Ag)
CONJUGADO
S
P

8. ENZIMOINMUNOENSAYOS (EIA)
FUNDAMENTO: utilización del poder amplificador que genera una reacción enzima-sustrato.
EIA
Homogéneos
(Fase líquida)
Competitivo
No
competitivo
Heterogéneos
(Soporte sólido
inmoviliza Ag o Ac)
Competitivo
No
competitivo
Indirecto
Captura o
Sandwich
https://www.youtube.com/watch?v=FmVV4e8evc8
https://www.youtube.com/watch?v=KrGC0ZgIDI8

9. Aplicaciones
CUALITATIVAS SEMICUANTITATIVAS CUANTITATIVAS
Presencia de Ag o de
Ac específicos en una
muestra
Título de Ac específicos
en una muestra
Concentración de
Ag en una muestra
(Diluciones seriadas del suero)
TÍTULO: la inversa de la última
dilución con un DO mayor al
cut-off
(Curva de calibración
con Ag standard)

10. ¿Cómo se determina el isotipo de un mAb?
(mAbs de determinado
isotipo y especificidad)
Lavados
Ac de captura anti-Ig
(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, o IgM)
Ac anti- cadena L ( o )
conjugado a enzima
Absorbancia
Sustrato +
Cromógeno
Lavados
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2017/11/pdb.top093823.abstract
Muestra
1
3
2 Bloqueo 4
5
6
7
8

11. Los EIA o ELISA permiten la detección de distintos tipos de moléculas
biológicas a muy bajas concentraciones y cantidades. Por lo tanto,
son considerados importantes herramientas para la investigación
científica básica y aplicada, así como también para el diagnóstico
clínico.
CONCLUSIÓN

12. Bibliografía
• Hornbeck P, Fleisher TA, Papadopoulos NM. Determinación de
isotipos de anticuerpos. Curr Protoc Immunol. 2017 2 de febrero; 116:
2.2.1-2.2.7. doi: 10.1002 / cpim.19.
• ”. Margni y col. Inmunología e inmunoquímica fundamentos –Capítulo
37: “Hibridomas y anticuerpos monoclonales. 5° Ed., 1996
• Frances Weis-Garcia and Robert H. Carnahan. Isotype Determination
of Rodent-Derived Monoclonal Antibodies Using Sandwich ELISA. Cold
Spring Harb Protoc. 2017.
• Edward A. Greenfield. Antibodies A Laboratory Manual, Second
edition, 2013