Las cepas se cultivaron en medio de agar nutritivo (OXOID) y se incubaron a 30 °C por 24 h. Una vez transcurrido el tiempo, se prepararon suspensiones bacterianas en agua estéril a una concentración de 9X108 UFC ml-1 (unidades formadoras de colonias), comparada con un patrón de turbidez McFarland número tres (McFarland, 1907).

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AMBIENTAL
TEMA:
RAOULTELLA TERRIGENA Y PECTOBACTERIUM
CAROTOVORUM EN HORTALIZAS EN DOS PROVINCIAS
DE COSTA RICA
CURSO:
BIOTECNOLOGÍA
DOCENTE:
BLGO. HERNAN HEBERT SOTO GONZALES
INTEGRANTES: GRUPO 06
• JUAN CARLOS BUSTINZA COAILA
• KAREN JULISSA COAPAZA CHAMBILLA
• MARTHA GABRIELA CUENTAS RIOS
• DIEGO HERNAN FLORES FLORES
• MAYRA VILCA OCHOA
CICLO:
VII
ILO – PERÚ
2021

2. R.T y P.C hortalizas en dos prov.
de Costa Rica
Materiales y
metodos
Recoleccion
de muestras
Alajuela
Cartago
- Chile dulce
- Hojas y bulbo
de cebolla.
- Plantas de
zucchini
- frutos de
tomate
- plantas de
tomate y papa.
Chile dulce
donde
de
usando
- Análisis moleculares.
- Analisis enzimáticos
- Técnicas de
patogenicidad.
Aislamiento
bacteriano
- Lavado de las muestras con agua esteril.
- Toma de 3 secciones dañadas, desinfectadas en
hipoclorito de sodio.
- Enjuagdas 3 veces en agua esteril.
- Se inoculo en 3 tubos con agua esteril y 3 con caldo
nut. y med. liq. pectina.
- Los tubos con agua se agitaron a 50 rpm por 5 min. Se
incubaron por 24h a 28°C.
- Los tubos con caldo nutritivo y med. liq. pectina se
mantuvo en condiciones de anaerobiosis y aceite
mineral, por 24h a 28°C.
- Se cultiva el resultado.
- Las colonias observadas se clasifican segun
morfologia y pruebas de tinción de Gram.
- Analisis de oxidasa, coloración MacConkey, crec.
anaerobico y pectinolisis en papa.
se realiza
metodos
donde
- Laboratorio Microbiología
Ambiental del Centro de
Investigación en Biología
Celular y Molecular
(CIBCM).
- Invernadero de
Microbiología de Suelos del
Centro de Investigaciones
Agronómicas de la
Universidad de Costa Rica.
instalaciones
Prueba de reacción
de
hipersensibilidad
- Las cepas se cultivaron en medio de agar nutritivo
(OXOID) y se incubaron a 30 °C por 24 h. Una vez
transcurrido el tiempo, se prepararon
suspensiones bacterianas en agua estéril a una
concentración de 9X108 UFC ml-1 (unidades
formadoras de colonias), comparada con un
patrón de turbidez McFarland número tres
(McFarland, 1907).
- Cada cepa se inoculó en cinco hojas, donde se
realizaron cuatro puntos de inoculación en cada
una, tres de las cepas bacterianas evaluadas y
una de agua estéril como control negativo. Se
aplicó aproximadamente 50 ?l por punto por
medio de presión en el envés de las hojas, con
una jeringa sin aguja, el proceso de inoculación se
llevó a cabo en el invernadero donde se
encontraban las plantas.
Actividad pectinolítica en
medio cristal violeta y
pectato
- Las bacterias seleccionadas se cultivaron en agar
nutritivo (OXOID) y se incubaron a 30 °C durante
24 h.
- El medio de CVP se preparó según lo descrito por
Schaad et al. (2001), donde se utilizó como fuente
de pectina el ácido polianhidrogalacturónico
(Sigma-Aldrich Ref. P3850). Se evaluó la
presencia o ausencia de cavidades en los puntos
donde fueron inoculados los aislamientos, lo cual
se determinó como la capacidad de las bacterias
de metabolizar la pectina presente en el medio.
luego
donde
por último
donde
Postulados de Koch
para aislamientos
seleccionados
- Se dio para aquellos
aislamientos causados
RH.
- Esto consiste en la
inoculación de bacterias
en hospederos sanos.
- El objetivo era verificar
si existe relación en
diferentes aislamientos
con pudrición.
Frutos de chile dulce Cebolla
Plantas de papa
- Se cultivaron en medio
de agar nutritivo
(OXOID)
- Se incubaron a 30 °C
por 24h.
- Se tomaron colonias
aisladas para preparar
suspensiones
bacterianas a una
concentración de 9X108
UFC ml-1
- Se uso frutos secos
para desinfectar con
hipoclorito de sodio al
2% en 3 minutos en
cámara de flujo laminar.
- Se remueve el exceso
de agua.
- Se realizo 4 Hoyos en el
pericarpio de 5.5mm y
se inocula 30ul.
- El resultado final indica
colocar en cámaras
húmedas, encubadas a
30°C sometido a
evaluaciones diarias
- Se coloca en bolsas
plásticas para aumentar
la humedad relativa.
- Siembra en bandejas de
72 celdas con suelo
estéril.
- A los 15 días de
emergidas, las plantas
(brotes de 10 cm altura)
se trasladaron al
invernadero del CIA.
- Se trasplantaron a potes
de 2 L y se realizó una
inoculación de 5 ml de
suspensión bacteriana.
- Los potes se rellenaron
con suelo y se colocaron
dentro de una caja
plástica.
- Para esta prueba se
utilizaron tres que
contenían tres plantas
cada uno. Dos se
inocularon con la bacteria
y uno con agua estéril
como control negativo.
- Las evaluaciones se
realizaron diariamente
durante 22 días.
- Se utilizaron bulbos
maduros de cebolla
- Se plantaron en potes
con 200 ml con suelo.
- Se inocularon con una
suspensión bacteriana a
una concentración de
10X8 UFC ml-1
- Se utilizaron 2 métodos
de inoculación: agregar 5
ml de suspensión
bacteriana en la siembra
del bulbo y el segundo en
inocular el mismo
volumen entre la base de
las hojas y el bulbo.
- Luego fueron trasladas al
invernadero y las
evaluaciones se
realizaron diariamente
durante 15 días.
donde
para
Extracción de
ADN y análisis
fligenéticos
Comparacion de cepa
inoculada con la
reaislada en los
postulados de koch
Análisis filogenético
del gen 16S ARNr
para las cepas
causantes de
pudrición blanda
- Se comparan las cepas
inoculadas con las
recuperadas mediante
amplificación.
- Se realizo un análisis
UPGMA.
- Extracción de ADN.
- Se amplifica mediante la
reacción en cadena
polimerasa (PCR).
- Se edito con el software
Bioedit.
- Se utilizó la herramienta
BLAST, para la
comparación con los de
la base de datos.
- Se alineo con el
Programa MEGA.
- El árbol se obtuvo por la
aplicación de 1000
réplicas y se visualizó.
- Los intervalos de
confianza se calcularon
en porcentaje.
se realiza
donde donde
se realizan