Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad.

1. Biotecnología para hacer frente
al cambio climático: la búsqueda
de variedades tolerantes a
sequía, frío y salinidad,
Barcelona 16-11-2011
José Miguel Mulet

2. ¿Que es el estrés para una planta?
•• EsEs difdifíícilcil dede definirdefinir aa nivelnivel general,general, puestopuesto
queque lolo queque puedepuede resultarresultar estrestrééss parapara unauna
plantaplanta parapara otraotra puedepuede queque no lo sea.no lo sea.
•• UnaUna definicidefinicióónn parapara salirsalir deldel pasopaso dede
estrestrééss biolbiolóógicogico serserííaa:: ““factor ofactor o condicicondicióónn
adversaadversa queque inhibeinhibe elel funcionamientofuncionamiento
normal de unnormal de un sistemasistema biolbiolóógicogico ((plantaplanta))””

3. ¿Por qué nos estresa que las
plantas se estresen?
• La población mundial es de 7.000 millones y creciendo.
• El estrés abiótico es el mayor factor limitante para la
productividad agrícola.
• El estrés abiótico produce pérdidas de cientos de
millones de euros cada año debido a bajadas de
producción o pérdida de cosechas.
• El crecimiento de la población ha acentuado los factores
de estrés existentes (básicamente metales pesados y
salinidad… quizás cambio climático).
¿Por que nos estresa que
las plantas se estresen?

4. Históricamente la sequía ha sido más definitivo
para el fin de una civilización que las guerras o las
epidemias
Existen más casos documentados como la civilización Maya, los indios pueblo,la
mesopotamia primitiva o la antigua camboya.

5. Imágenes tomadas en Tempe (Arizona, USA), que muestran el
efecto de vaias décadas de irrigación (Gentileza del Dr. Roberto
Gaxiola)
La sequía y la salinidad son problemas actuales tanto en países desarrollados
como en países en desarrollo

6. La Mejora Clásica se ha demostrado muy buena para el aumento de la productividad,
pero limitada en tolerancia a condiciones ambientales adversas
Trigo tradicional:
Bajo radio grano/paja
Trigo de la revolución verde:
Alto radio grano/paja
Norman Borlaug (2009)
Premio Nobel de la Paz

7. La cuestión es: ¿Qué gen elegir
para hacer plantas tolerantes?
O dicho de otra manera: ¿Por
qué no hay todavía plantas
tolerantes a estrés abiótico en el
mercado?

8. Para aplicar ingeniería genética es preciso
conocer el efecto a nivel celular… y elegir
un gen

9. Estrategias basadas en
conocimiento previo
•• GeneticaGenetica reversareversa::
–– PartiendoPartiendo dede datosdatos obtenidosobtenidos deldel genomagenoma clonarclonar genes congenes con unauna
funcifuncióónn determinadadeterminada y/oy/o construirconstruir lineaslineas modificandomodificando lala
expresiexpresióónn del gendel gen queque nosnos interesainteresa..
•• GenGenóómicamica funcionalfuncional::
–– EstudiarEstudiar queque genes segenes se expresanexpresan o seo se reprimenreprimen enen determinadasdeterminadas
condicionescondiciones dede estrestrééss y ay a partirpartir dede estosestos datosdatos modificarmodificar lala
expresiexpresióónn de genes dede genes de relevanciarelevancia..
•• IngenierIngenierííaa GenGenééticatica::
–– TransformarTransformar unauna plantaplanta con un gen decon un gen de otrootro organismoorganismo dede
probadaprobada funcionalidadfuncionalidad enen determinadodeterminado estrestrééss..

10. Así es como representamos una
ruta de respuesta

11. Tolerancia a estrés
Factores
negativos
Factores
positivos
Cuello de botella
Unico gen que dará tolerancia por sobrexpresión
Pérdida de Función
redundancia
Pero realmente se parece a esto

12. Un ejemplo: Optimizar la síntesis de
osmolitos para tolerancia a sequía
• La síntesis de osmolitos es una estrategia
generalizada para retener el potencial osmótico
dentro de la célula.
• El problema es que no es una respuesta
conservada, y cada organismo parece que ha
encontrado su solución particular… lo que
dificulta el diseño de estrategias…
• Las diferentes estrategias han fracasado
(incluso después de haber funcionado bien en el
laboratorio).

13. El Yield Penalty, un indeseado efecto secundario
Theor Appl Genet. 2007 Jun;115(1):35-46. Epub 2007 Apr 11.
Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.
Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L.

14. Un gen puede dar tolerancia por
sobreexpresión por:
• Mejorar la respuesta a estrés
(señalización).
• Mejorar la respuesta a estrés (defensa).
• Ser una diana molecular del estrés.
• Regular negativamente un factor negativo.
• Ser un factor negativo (la mutación daría
tolerancia).

15. ¿Por qué no cambiamos la
estrategia?
•• ElEl trucotruco eses cambiarcambiar lala afirmaciafirmacióónn:: ““esteeste
gengen queque conozcoconozco funcionarfuncionaráá”” porpor :: ””voyvoy aa
buscarbuscar genesgenes queque funcionenfuncionen,, aunqueaunque nono
loslos conozcaconozca””, ergo:, ergo: hacerhacer unun screening.screening.
•• ElEl problemaproblema eses:: ¿¿CCóómomo??

16. La levadura como instrumento para buscar genes
Overexpression libraries
Yeast genomic fragments
+
Yeast multicopy plasmid
Saccharomyces cerevisiae
Selection for salt tolerance
NaCl or
LiCl
medium

17. setting energization
ATP
ADP
+ Pi
H+
Pma1
K+
Trk1
+++
---
Li+, Na+
Polyaminesn+
Aminoglycosidesn+
?
?
?
ΔΨ
K+ starvation
Na+ stress
Osmotic stress
Hal4,5 Hal1
CN
Acid stress
Alkaline
stress
Ppz1.Hal3
Glucose
metabolism
YCK1,2
Ptk2
Plasma membrane
Este sistema nos permitió descifrar la
homeostasis de iones en levadura

18. 35S::HAL1 control
10 days with
150 mM NaCl
20 days with
150 mM NaCl
THE YEAST HAL1
GENE IMPROVES
SALT TOLERANCE IN
TOMATO
(cultivar P73; Gisbert et al.,
Plant Physiol. 123 (2000) 393-
402; collaboration with the
group
of Vicente Moreno)
… and in water melon
(Ellul et al., 2003,
Theor. Appl. Genet.
107: 462-469)
Y también alguna aplicación en plantas

19. Ya que la levadura funciona muy
bien para encontrar genes de
levadura…
•• ……PorPor queque nono buscarbuscar genes degenes de plantasplantas??
•• VentajasVentajas::
•• Es unEs un procesoproceso rráápidopido yy baratobarato..
•• EnEn pocopoco tiempotiempo sese puedepuede hacerhacer unun escrutinioescrutinio exhaustivoexhaustivo..
•• InconvenientesInconvenientes::
•• NoNo todostodos loslos cDNAcDNA sese expresanexpresan bienbien en losen los sistemassistemas
heterheteróólogoslogos ((problemasproblemas con elcon el codoncodon usage).usage).
•• MuchasMuchas rutasrutas nono estestáánn conservadasconservadas..
•• SueleSuele salirsalir unun sesgosesgo haciahacia moleculasmoleculas efectorasefectoras,, pocaspocas
seseññalizadorasalizadoras, y, y poqupoquíísimassimas proteproteíínasnas dede membranamembrana..

20. La levadura como instrumento para buscar genes
Overexpression libraries
Plant cDNAs
+
Yeast multicopy plasmid
with strong promoter
Saccharomyces cerevisiae
Selection for salt tolerance
NaCl or
LiCl
medium

21. Genes de halotolerancia de la planta modelo Arabidopsis thaliana encontrados por sobreexpresión en levadura
(Forment et al., 2002, Plant J. 30:511-519; collaboration with the group of Oscar Vicente )
Name Times isolated Mechanism of action
RCY1 3 K/T-type cyclin fused to an RS-domain
typical of splicing proteins
SRL1 3 RS-domain typical of splicing proteins
AtU1A 1 U1A protein of the spliceosomal U1-snRNP
TECHNICAL DATA
Yeast strain G19 (ena1-4::HIS3)
Library of F. Lacroute (Plant J. 1992, 2: 417-422): Arabidopsis seedlings grown in vitro
Minimal medium with 25 mM LiCl and 0.4 mM methionine
750.000 transformants tested

22. OVEREXPRESSION OF SRL1 CONFERS
SALT TOLERANCE TO TRANSGENIC
ARABIDOPSIS PLANTS
In vitro germination
3-weeks old plants
treated for 20 d with
200 mM NaCl
aborted siliques
normal siliques

23. AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Xho I
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
cDNA
S. cerevisiae
(ena1-4 nha1)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a salinidad. (Col.
Con Roc Ros, U. de Valencia)

24. Genes de remolacha obtenidos en el escrutinio de tolerancia
a salinidad
Clone Number of Predicted function Motifs
times isolated
BvSATO1 6 RNA binding protein RGG and RE/D
BvSATO2 1 Homologous to BvSATO1
BvSATO3 1 RNA binding protein P-rich and Zn-finger
BvSATO4 1 RNA binding protein RBD
BvSATO5 1 RNA binding protein
BvSATO6 1 RNA binding protein RBD
BvU2AFsnRNP 3 RNA binding protein RBD and Zn-finger
BvSATO7 1 No homologies
BvCK2a 1 Protein kinase CK2
BvURA4 2 Dihydroorotase (uracil biosynthesis)
BveIF-1A 3 Translation initiation factor

25. 35S::BvSATO1 control
35 days growth with
without stress
35 days growth with
50 mM NaCl

26. PATENT TITLE: Protection against environmental toxicity through manipulation of the
processing of messenger RNA precursors
Inventors : O. Vicente-Meana, M. Roldan-Medina, R. Serrano-Salom, J. J. Forment,
M. A. Naranjo-Olivero, R. Ros Palau, R. Khanonou
Priority date: 19 April 2000
Filing date : 19 April 2001
PCT publication date: 01 November 2001
(transferred to Crop Design, now part of BASF)
AN EXAMPLE OF A PATENT TOO SPECIFIC
Because 8 years later an RNA binding protein provided drought tolerance in corn:
News release, Monsanto (St. Louis, USA) and BASF (Ludwigshafen, Germany), June 9, 2009
Monsanto, BASF scientists disclose discovery of gene conferring drought
tolerance in corn plants: bacterial cspB gene encoding an RNA binding protein
Gene provides yield stabilty
during periods of inadequate
water supply
Control plants

27. AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Xho I
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
cDNA
S. cerevisiae
(gpd1)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a sequía.

28. Resultados del escrutinio en
sequía
cDNAs identificados en 1.7 M de Sorbitol
YPD XERO1 Serine O-Acetyltransferase
XERO2 Type II Plant Haemoglobin
SD XERO3 Ascorbate Peroxidase 3
No incluidos en la patente
Incluidos en la patente

29. HomoserineHomoserine
Acetil-CoA
O-acetylhomoserineO-acetylhomoserine
HomocysteineHomocysteine
cystathioninecystathionine
CysteineCysteine
[MET2]
[STR4]
[STR1/CYS3]
CoA
S2-
Serine
[MET15]
SerineSerine
CysteineCysteine
O-acetylserineO-acetylserine
S2-
XERO1
Acetil-CoA
CoA
¿Por que da tolerancia un gen que no está
conservado?
Recientemente se ha demostrado que este gen
puede ser clave para el desarrollo de estrategias de
fitorremediación
(Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007)

30. Actualmente tenemos arroz que
sobreexpresa este gen
Y hemos empezado una colaboración con
Carmina Gisbert (COMAV, Valencia) para
sobreexpresar XERO1-3 en tomate y
berengena

31. AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Xho I
Xho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmid
pYPGE15
cDNA
S. cerevisiae
(wt)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a frío.

32. Resultados del escrutinio en frío
cDNAs identificados a 10 ºC
YPD CRIO1 (8) ScDID1 / AtSNF7 / CHMP4 / VPS32
CRIO2 (2) Homólogo de CRIO1
CRIO3 (4) ScDID2 / AtVPS46/CHMP1
CRIO4 (1) PDR16 / SEC14
SD CRIO5 (1) Proteína “Ring Finger”
CRIO6 (1) Proteína intrínseca de tonoplasto
SDCOLD1 (2) Cadena corta de la rubisco
SDCOLD5 (1) Proteína de unión a clorofila

33. CRIO1,2 localizan en el MVB en
células vegetales

34. N. Of branches/plant
0
1
2
3
4
wt L3 L8 L9
Crecimiento de las plantas RD29A::CRIO2 a 10 ºC
0% 25% 50% 75% 100%
wt
Line 3
Line 8
Line 9
Vegetative
Bolting
Inflorescence
Floral
N. Of Flowers/plant
0
2
4
6
wt L3 L8 L9
hypocotyl length
0
2,5
5
7,5
10
wt L3 L8 L9

35. La levadura funciona bien
Pero no es una planta

36. Buscar genes de plantas en
plantas
•• VentajasVentajas::
•• TrabajanTrabajan ““In situIn situ””,, porpor lolo queque evitasevitas elel sesgosesgo de losde los
sistemassistemas heterheteróólogoslogos contracontra laslas proteproteíínasnas dede
membranamembrana oo laslas proteproteíínasnas reguladorasreguladoras..
•• LasLas variedadesvariedades obtenidasobtenidas puedenpueden ser deser de utilidadutilidad
immediataimmediata..
•• DesventajasDesventajas::
•• SistemaSistema carocaro y lento.y lento. RequiereRequiere unauna infraestructurainfraestructura
complicadacomplicada..

37. Primera aproximación: Colecciones de mutantes no marcadas (ganancia o
pérdida de función)
Sodium transporters
SOS1 (extrussion in roots)
HKT1 (phloem loading in shoots
and xylem retrieving in roots)
Regulators
SOS2-SOS3 (Ca-PK)
SAL1 (PAP and inositol polyphosphatase)
ABA (ABA2, ABA3, ABI4)
Antioxidants
Catalase
General metabolism
SOS4 (pyridoxal kinase)
SOS5 (arabinogalactan protein)
Calcium signaling
ABA signaling
H2O2 detoxification
Defects in fundamental processes
compromise adaptation to diffferent
stresses
Problemas: No identifica factores limitantes, Proyectos muy largos y caros

38. Las colecciones marcadas: Una especie de solución
para encontrar genes de tolerancia
Activador Transcripcional
T-DNA
RB LB
• Activation tagging:Activation tagging: ConstrucciConstruccióónn concon cuatrocuatro
copiascopias en tandem delen tandem del promotorpromotor del 35S. Endel 35S. En
funcifuncióónn deldel sitiositio dede inserciinsercióónn puedepuede ocasionarocasionar lala
sobreexpresisobreexpresióónn de un gen.de un gen.
•• ElEl problemaproblema eses queque aa vecesveces sese consigueconsigue lala
sobreexpresisobreexpresióónn dede unauna copiacopia truncadatruncada o lao la
sobrexpresisobrexpresióónn de unde un antisentidoantisentido..

39. A dominant mutation
conferring pleiotropic
tolerance to toxic cations
Alejandro et al. (2007) EMBO J. 26: 3203-3215
(tesis doctoral de Santiago Alejandro; colaboración con los grupos de
Pedro L. Rodriguez y José A. Fernández)

40. Y ahora que?
• Los genes SATO, CRIO1-5 y
XERO2 han sido introducidos
en maíz, colza, soja y algodón
y están actualmente en
evaluación en campo.
• …Quizás algún día tengamos
plantas tolerantes con genes
que encontramos en el
laboratorio de Valencia

41. ¡¡¡Gracias por la vuestra atención!!!
• Si teneis ganas de más: ( @jmmulet)
• www.losproductosnaturales.com