2. RATONES KNOCK-OUT
Mario Capecchi, Martin Evans y
Oliver Smithies (1987-1989)
creado modelos para el estudio de
enfermedades, como la arterosclerosis, el
cáncer, la fibrosis cística, el Parkinson, etc.
Para inactivar un gen, se requiere llevar a cabo 2 pasos distintos
Primero se construye un vector el que se introduce en células
madre embrionarias
Gen de resistencia a la neomicina: Gen al azar: Gen exógeno:
electroporación
3. A continuación, se selecciona a los ratones con manchas marrones y blancas en su pelo para
cruzarlos entre sí y propagar así el gen knockout.
En el segundo paso
insertar en un blastocisto de ratón
completar el ciclo
de gestación
para
contienen 2 tipos de células
las originales genéticamente modificadas
quimeras
A menudo, las células embrionarias genéticamente
modificadas proceden de ratones que producen
animales con pelo marrón, y los blastocistos a los que
se inyectan estas células proceden de ratones que
generan animales con pelo blanco
si el pelo de los ratones tiene manchas marrones y
blancas, la inyección de las células knockout
embrionarias tuvo éxito
- Se busca que todas las células del cuerpo tengan el gen (alelos) inactivo-
MARTÍNEZ-HERRERO et al, 2012
11. Knockout condicionales
inactivar un gen únicamente
estado de desarrollo
órgano tipo celular
método de la recombinasa Cre-loxP
¿Cómo los obtengo?
La recombinasa Cre es una enzima que
actúa como una tijera para cortar un gen
que está flanqueado por 2 secuencias
diana denominadas loxP.
Cuando Cre se expresa, se une a los
loxP, los corta y después empalma las
2 mitades restantes, tras haber
eliminado el ADN situado entre ellos.
Debido a que esta enzima se expresa
sólo en ciertos tipos de células, el gen
diana se inactiva únicamente donde
el investigador lo desea.
Cre se puede poner bajo el control de
un promotor inducible (por ejem. un
fármaco, hipoxia, ayuno, etc.)
12.
13.
14. Inducir la expresión de una proteína o anular dicha expresión “in vivo”, de forma
irreversible, en un mismo individuo
Expresión inducible de transgenes: sistema regulado por tetraciclina
(tet)
operón tet
mediante
1° proteína, el represor tet (tetR)
secuencia de ADN conocida como
operador tet (tetO)
se une
transcripción de los genes del operón
inhibe
La tetraciclina o doxiciclina
impide la unión de tetR a tetO
transcripción de los genes del operón
favorece
Existen dos sistemas: TetOff y TetOn
16. RATONES KNOCKIN
Modificación de un codón concreto en la secuencia codificante para generar un cambio de
aminoácido en la proteína correspondiente o la sustitución de la secuencia codificante de un gen,
o de uno de sus dominios, por la de otro.
introducen mutaciones dirigidas
secuencia de un determinado gen
en la
ejemplo
Obtención
Igual que los knockout
Uso de Cre y loxP
Inicialmente los ratones knockout eran producidos
por sustitución o disrupción de los exones
codificadores de un gen con un marcador
farmacológico. Estos ratones podían ser utilizados
para estudiar solamente los efectos de la pérdida de
un gen, pero no de una mutación específica. Para
este ultimo fin, se desarrolló un método de
"knock-in", en el que se intercambia una secuencia
de ADN endógeno es sustituida por una de ADN
mutado sin ninguna otra disrupción del gen
correspondiente.
17. ❖ El sitio de la integración es bien sabido.
❖ Los knockins condicionales y constitutivos son también
posibles.
❖ Esta técnica es más compatible con un sistema inducible
que permita el estudio de los efectos de la mutación que
se asemejan de cerca a la causa de la enfermedad
humana.
❖ Permite el estudio de los efectos de genes con funciones
alteradas.
❖ El estudio de la proteína funcional puede ser
profundizado realizado.
Ventajas del método del knockin
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/ge
ne-knockin
Estudios
18. ❖ El revelado de la complejidad ocurre debido a la combinación de los transgenes que llevan a
muchos efectos secundarios.
❖ El énfasis excesivo forzado de los genes produce los artefactos que llevan a la acción recíproca
no específica de la proteína-proteína.
❖ Este método tarda más tiempo para encontrar las células que han experimentado la
recombinación de la homología y para agrupar el vector.
❖ El ratón del knockin generado no se asemeja totalmente a la patología de la enfermedad
humana.
❖ El knockin condicional del gen exógeno tal como gen del reportero se puede lograr solamente
en presencia de lugares geométricos bien caracterizados tales como ROSA26. Esto aumenta la
dificultad en la combinación del transgén y del gen en el mismo lugar geométrico.
❖ Método costoso.
Limitaciones del método del knockin
MICHAN, PH y CASTILLO, (2011)
19. RATONES KNOCK-DOWN
se basa en inducir la supresión total o
parcial de una proteína determinada,
sin alterar la secuencia nucleotídica
ARN de interferencia
en células madre
silenciamiento
vectores víricos
Ventaja:
no se requiere homocigosis
Neuronas que sirven
para percibir el aroma
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REFERENCIAS