Este documento describe diferentes técnicas para generar ratones transgénicos con modificaciones genéticas, incluyendo ratones tradicionales transgénicos, ratones knockout con genes inactivados, y ratones knockin con genes reemplazados. También describe el uso de estas técnicas para estudiar el desarrollo y activación de linfocitos, así como las limitaciones de estas aproximaciones. Finalmente, introduce ratones informadores fluorescentes y el sistema CRISPR/Cas9 como nuevas formas de modificar genes.

1. FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
RATONES TRANSGÉNICOS E
INACTIVACIÓN GÉNICA
DIRIGIDA

2. RATONES TRANSGÉNICOS E
INACTIVACIÓN GÉNICA DIRIGIDA
Para estudiar los efectos de productos génicos
específicos en vivo:
o Ratones transgénicos tradicionales.
o Ratones con genes “inactivados” (knockout).
o Ratones “knockin”.
Estas técnicas se han usado para analizar el
desarrollo, la activación y la tolerancia de los
linfocitos.

3. RATONES TRANSGÉNICOS
TRADICIONALES
 Se introduce ADN ajeno, los transgenes.
 La mayor parte de las crías transgénicas (75%) lleva el
transgén en todas sus células, incluidas las germinativas.
 La integración del ADN ajeno no interrumpe el
funcionamiento de los genes endógenos.
 Esta técnica se puede utilizarse para expresar genes en
tejidos concretos.
 Los transgenes también pueden expresarse a la acción de
un fármaco o de una hormona, como la tetraciclina o los
estrógenos.

4. RATONES CON GENES “INACTIVADOS”
(KNOCKOUT)
 Ratones con genes inactivados mediante su mutación o ruptura.
 Basado en la recombinación homóloga.
 La selección de células que hayan experimentado una recombinación homóloga está basada en el uso
de fármacos.
 El fragmento del ADN homólogo que se pretende introducir en una célula se coloca en un vector que
contiene un gen de resistencia a la neomicina y un gen de la timidina cinasa (tk) vírica.
 Este vector dirigido se elabora de modo que el gen de resistencia a la neomicina se agregue siempre al
ADN cromosómico, pero el gen tk se pierda en cada recombinación homóloga.
 El vector se introduce en las células, que crecen en un ambiente con neomicina y ganciclovir.
 Las células en las que el gen se integra al azar serán resistentes a la neomicina, pero acabarán
destruidas por el ganciclovir, mientras que las células en las que haya producido la recombinación
homóloga serán resistentes a ambos fármacos.
 La presencia del ADN añadido en medio de un gen endógeno puede suprimir la expresión o el
funcionamiento de ese gen.

6. RATONES CON GENES “INACTIVADOS”
(KNOCKOUT)
 Para generar un ratón que porte una mutación elegida en un gen, se emplea un
vector en células troncales embrionarias (ES) murinas.
 Luego se seleccionar las células en las que haya recombinación homóloga por
medio de fármacos y se inyectan en los blastocistos.
 Los ratones surgidos serán quiméricos, es decir, una parte de los tejidos
derivarán de las células ES y otra parte del resto del blastocisto normal.
 Si los ratones “quimera” se cruzan con animales normales todas las células de la
prole derivadas de dicho cigoto serán heterocigóticas respecto a la mutación.
 Estos ratones heterocigóticos pueden aparearse entre sí y producir animales que
van a ser homocigóticos con respecto a la mutación. Estos ratones con los genes
inactivados no expresan el gen elegido.

8. RATONES “KNOCKIN”
 La recombinación homóloga también puede utilizarse para
sustituir una secuencia génica normal por una versión
modificada del mismo u otro gen, lo que crea una cepa de
ratones “knockin”, a diferencia de la eliminación de un gen.
 El método “knockin” podría usarse para reemplazar un gen
defectuoso.
 Los métodos “knockin” se emplean cuando es deseable que
ciertas secuencias endógenas de ADN regulen la expresión
del transgén, como pueden ser un potenciador o una región
promotora concretas.

9. LIMITACIONES
o La mutación de un gen durante el desarrollo puede compensarse con la expresión de
otros productos génicos.
o En un ratón “knockout” no es fácil evaluar la importancia de un gen en un solo tejido.
o Al introducir un gen marcador en un ratón, como el gen de resistencia a la neomicina, y
podría tener consecuencias imprevisibles en su fenotipo.
 Por ello se aprovecha el sistema de recombinación Cre/loxP derivado de los bacteriófagos.
 Para generar ratones con genes marcados con loxP, se construyen vectores con un lugar
loxP flanqueando al gen de resistencia a la neomicina en un extremo y un segundo lugar
loxP que flanquee las secuencias homologas por el otro extremo.
 La cepa portadora del gen elegido flanqueado por loxP se cruza con una segunda cepa de
ratones que lleven el transgén cre. En la prole obtenida, la expresión de la recombinasa Cre
participará en la supresión del gen de interés. Así, se eliminarán las secuencias normales y
el gen de resistencia a la neomicina.

10. RATONES “INFORMADORES” Y
CRISPR/Cas9
 Las células que normalmente expresarían una proteína particular
expresarán una molécula fluorescente al mismo tiempo que la proteína
original. Se ha obtenido visualizar células inmunitarias en vivo, como los
ratones en los que los linfocitos TH17 productores de IL-17 también
expresan una proteína fluorescente.
 Una nueva forma de generar mutaciones utiliza una modificación de un
sistema de defensa bacteriano contra ADN extraño llamado sistema
CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas con espacios
intermedios regulares)/Cas9 (nucleasa asociada a CRISPR 9). Este es el
sistema más rápido para generar mutaciones por inactivación (knockout)
o inserción (knockin) en líneas celulares o líneas germinales de animales
experimentales.