El Genoma Humano, Características, Definición, ETC
Correlación de la actividad EEG en ratones transgénicos
1.
2. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Placa amiloidea y ovillos neurofibrilares como contraste de la Enfermedad de Alzheimer. La EA es una
enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la presencia de placas seniles, ovillos neurofibrilares
y perdida neuronal. www.intechopen.com.
3. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER
Placas neurofibrilares dispuestas en áreas
focales y difusas. Anatomía patológica.
Fundación CIEN
Anatomía patológica. Lesiones características
de la demencia senil. Santiago Ramón y Tello,
1930. Cortesía Juan De Carlos, Instituto Cajal.
4. MODELO DERATON (NUMERO) NOMBRECOMUN PLACAS
B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax (004807) 3XTg-AD IN 3-4m, E6m- LHP
B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax (004462) APPswe/PS1dE9 HP, CC 6-7m
B6.129-Tg(APPSw)40Btla/Mmjax (005300) R1.40-YAC HP, CC 14m
B6.Cg-Nos2tm1Lau Tg(Thy1-APPSwDutIowa)BWevn/Mmjax (009126) APPSwDI/NOS2 12-13m
C57BL/6-Tg(Thy1-APPSwDutIowa)BWevn/Mmjax (007027) APPSwDI HO, CC 3m
B6.Cg-Tg(PDGFB-APPSwInd)20Lms/2Mmjax (006293) hAPPJ20 HP, CC 6- 8m
B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax (006554) 5XFAD HP,CC 2m
B6;C3-Tg(Prnp-MAPT*P301S)PS19Vle/J (008169) P301S tau NO
B6.Cg-Mapttm1(EGFP)Klt Tg(MAPT)8cPdav/J (005491) hTau; tauGFP NO
STOCK Tg(Camk2a-tTA)1Mmay Tg(tetO-ABL1*P242E*P249E)CPdav/J (015838) AblPP/tTA NO
FVB-Tg(tetO-MAPT*P301L)#Kha/JlwsJ (015815) rTg4510 NO
5. OVILLOS PERDIDA SINAPTICA PERDIDA NEURONAL DEFICITCOGNITIVO
HP >6m, despues CC no reportada no reportada 4m
NO neuritis distrofica-9m no reportada deficitaprendizaje espacial 7m
NO neuritis distrofica14m no reportada no reportada
SI -Tau 12.-13m no reportada si deifici aprendizaje y memoriaespacial 12-13m
NO no reportada no reportada deficitdel aprendizaje y memoriaespacial 3m
NO 2-4m no reportada deficitdel aprendizaje espacial 6-7m
NO 4m si deficitdel aprendizaje espacial 4-5m
HP-NC 5m si HP 8-9m no reportada
HO-NC 2m si si no reportada
NO no reportada CA1- HP no reportada
CC4m no reportada SI deifictde memoriaespacial 4m
7. β-amiloide (Aß) y actividad epileptiforme
Nature Medicine 9, 994 - 996 (2003)
doi:10.1038/nm0803-994
8. El objetivo general del trabajo se desarrolla a partir de los siguientes objetivos concretos:
Objetivo 1. Determinar si existen eventos relacionados con la actividad epiléptica y el
análisis de las características en el registro electroencefalográfico en ratones controles y ratones
transgénicos APP/PS1 (3, 6 y 18 meses) que ya han desarrollado la enfermedad.
Objetivo 2. Determinar si la presencia de puntas epilépticas está relacionada con la
disminución de la actividad colinérgica en la corteza cerebral.
Objetivo 3. Determinar si la presencia de placas de b-amiloide se correlaciona con la
actividad epileptiforme en estos animales transgénicos.
10. Animales control y transgénicos
3-6-18 meses
Anestesia
Mesa de operaciones- coordenadas estereotaxicas
Registro de la actividad EcG
Utiliza Spike 2 – Análisis
1- espectro de potencia
2- detección eventos
12. ¿Existen o no, eventos relacionados con
la actividad epiléptica en ratones
transgénicos APP/PS1 , a diferentes
edades (3, 6 y 18 meses)?
13. TIPO ACTIVIDAD DURACION CARACTERISTICA
S
PUNTA 20-30 ms Pl +(+) or (-) 2 amp
PUNTAS AGUDAS 70-200 ms Amp variable
PUNTA-ONDA L > 200 ms =
POLIPUNTA 20-30 ms +S+S =
POLIPUNTA-ONDA S+ >200 MS =
ACTIVIDAD ICTAL S+PS+SLW-5sg =
14. Actividad electroencefalografica registrada en la corteza somestésica de ratones control y transgénicos. A,
ejemplos de spikes y polispikes que fueron frecuentes en los registros EcoG. B, gráfica del porcentaje spikes,
polispikes y Sharp waves en ratones control y transgénicos
15. ¿está la actividad epiléptica relacionada
con la disminución de la actividad
colinérgica en la corteza cerebral?
16. Proporción de las bandas de frecuencia del EcoG en animales control y APP/PS1
antes y después de la aplicación de fisiostigmina
17. Proporción de actividades electroencefalográficas antes y después de la
aplicación intraperitoneal de fisostigmina
18. ¿la presencia de placas de b-amiloide se
correlaciona con la actividad
epileptiforme en estos animales
transgénicos?
19. Correlación entre el nº de placas de β-amiloide (Aß) y el número de spikes en
ratones APP/PS1.
20. Los ratones modelo de la enfermedad de Alzheimer
APP/PS1 presentan una actividad epileptiforme.
Estos animales no presentan epilepsia sino descargas
aisladas que pueden indicar un aumento de la
excitabilidad cortical.
21. Los ratones APP/PS1 también presentaron una
disminución de la respuesta colinérgica
respecto a los ratones control .
Existe una correlación entre el número de
descargas epilépticas y el número de placas de
Aβ.
Las descargas epilépticas aparecen es estadios
tempranos del modelo en ratón de la EA.
Notas del editor
Placa amiloidea y ovillos neurofibrilares como contraste de la Enfermedad de Alzheimer. La EA es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la presencia de placas seniles, ovillos neurofibrilares y perdida neuronal. www.intechopen.com.
La enfermedad del Alzheimer (AD) se caracteriza por demencia, que típicamente comienza con una sutil pérdida de memoria y lentamente se hace más severa y, ocasionalmente, incapacita. Otros síntomas comunes son confusión, perdida de juicio, lenguaje confuso, nerviosismo, retiro y alucinaciones. El 25% de los casos de Alzheimer se deben a herencia familiar, de los cuales el 95% se inicia después de los 65 años y sólo el 5% antes de esa edad. La AD que comienza entre los 60 y 65 años, e incluso antes de los 55, se conoce como AD familiar de diagnóstico temprano (EOFAD). Se han identificado 3 genes implicados en la EOFAD: APP, PSEN1 y PSEN2. Mutaciones en el gen APP se asocian con el Alzheimer tipo 1 (AD1), que representa alrededor del 10-15% de los casos de EOFAD. Mutaciones en PSEN1 son responsables de Alzheimer tipo 3 (AD3), que es el más frecuente (entre el 30 y 70% de EOFAD). Mutaciones en PSEN2 se asocian con el Alzheimer tipo 4 (AD4), que explica casi el 5% del EOFAD. En caso de resultado negativo para los genes APP, PSEN1 y PSEN2, nuestro laboratorio ofrece el estudio de los genes MAPT, APOE, CLU, PICALM y CR1, que también se han asociado con EOFAD
2. Amyloid plaque and neurofibrillary tangles as hallmarks of Alzheimer disease (AD).
AD is a progressive neurodegenerative disease characterized by senile plaques,
neurofibrillary tangles and neuronal loss. Abnormal aggregates of amyloid-beta peptide
(A┚) are found in extracellular senile plaques and associated with neurodegeneration in AD.
Neurofibrillary tangles are aggregates of the microtubule-associated protein (MAP) tau
protein which is hyperphosphorylated by kinases and accumulated inside the neurons
themselves
Nuestra última vista de la β-amiloide (Aß) hipótesis de la cascada y la remodelación del hipocampo resultante. A, altos niveles de Aß inducen la actividad epileptiforme, que desencadena respuestas inhibitorias compensatorios para contrarrestar sobreexcitación. Tanto aberrante actividad neuronal excitatoria e inhibitoria respuestas compensatorias pueden contribuir a la enfermedad de Alzheimer déficits cognitivos relacionados con la enfermedad. B, remodelación circuito de Aß-dependiente en el giro dentado del precursor de amiloide proteína ratones transgénicos humanos (hAPPJ20). En contraste con los ratones no transgénicos (NTG), hAPPJ20 ratones muestran una mayor brotación de los terminales axonales inhibitorios en la capa molecular, la inhibición sináptica mejorada, ectópico neuropéptido Y (NPY) expresión en las células granulares, y el agotamiento de las proteínas dependientes de la actividad como calbindina, Arc y Fos. Estos cambios reflejan probablemente las respuestas inhibitorias compensatorias a la actividad excitatoria neuronal aberrante. CB indica calbindina; GABA, ácido γ-aminobutírico, Glu, glutamato; PV, parvalbúmina y SOM, SOMATOSTAINAGlu, glutamato; PV, parvalbúmina y SOM, somatostatina. Adaptado de la revista Neuron . β-amiloide (Aß) puede afectar a la actividad neuronal en múltiples niveles de complejidad. Los altos niveles de Aß deprimen la transmisión sináptica excitatoria y perjudican la plasticidad sináptica en el nivel de las sinapsis específicas (A), pero provocan convulsiones y actividad epileptiforme en el nivel de red (B).Sobre la existencia de una relación causal entre estos efectos Aß es desconocida. F indica frontal; fEPSP, campo de los potenciales excitatorios postsinápticos, H hipocampo; hAPPJ20 proteína precursora de amiloide en ratones transgénicos, humanos, L, izquierda, NTG, los ratones no transgénicos, S, posterior-parietales; P, parietales, R, derecha, T, temporales ; y TBS, estimulación θ-ráfaga. Adaptado de la revista Neuron 4 y Nature . 22
El objetivo general del trabajo se desarrolla a partir de los siguientes objetivos concretos:
Objetivo 1. Determinar si existen eventos relacionados con la actividad epiléptica y el análisis de las características en el registro electroencefalográfico en ratones controles y ratones transgénicos APP/PS1 (3, 6 y 18 meses) que ya han desarrollado la enfermedad.
Objetivo 2. Determinar si la presencia de puntas epilépticas está relacionada con la disminución de la actividad colinérgica en la corteza cerebral.
Objetivo 3. Determinar si la presencia de placas de b-amiloide se correlaciona con la actividad epileptiforme en estos animales transgénicos.
Se utilizaron ratones C57BL6/J como controles (n= 8; 5 machos ,3 hembras ) y ratones transgénicos APP/PS1 (n= 3 machos ,4 hembras ) de la estirpe B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax de “The Jackson Laboratory”. Estos ratones transgénicos presentan una alta incidencia de puntas epilépticas a edades tempranas de 3-4 meses de edad (Minkeviciene et al. J Neurosci. 2009). La edad de los ratones osciló entre 3 y 12 meses y su peso entre 25 y 36 g. En las instalaciones del Animalario de la Facultad de Medicina UAM se mantuvieron los animales en condiciones controladas de temperatura (22± 2ºC) y humedad (50±10%), en ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y alimentados ad libitum con agua y pienso compuesto comercial esterilizado por irradiación. Todos los experimentos realizados en este estudio se sometieron a la evaluación del Subcomité de ética de la Universidad Autónoma de Madrid. El mantenimiento, manipulación, anestesia y eutanasia de los animales cumplió en todos sus extremos la normativa española vigente (Real Decreto 1201/2005 de 10 de Octubre sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos y Ley 32/2007 de 7 de Noviembre para el cuidado de los animales en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio) y europea (Directiva 2010/63/CE que modifica la Directiva 86/609/CEE).
Los animales fueron inicialmente anestesiados con una mezcla de ketamina (75 mg/Kg) y xilacina (10mg/Kg) para su colocación en el aparato estereotáxico. Después de administrada la anestesia vía intraperitoneal se introdujo a los ratones en una cámara de inducción dónde se les aplicó 2,5% de Isofluorano en un flujo de oxígeno de 0,4 L/m. Una vez inducidas y a lo largo de la cirugía, se mantuvo la anestesia a 0,5% mediante una máscara apropiada para ratón (Fig. 5). Después de exponer la calota, se realiza con un trépano una agujero sobre la corteza somestésica. Las coordenadas estereotáxicas medidas desde el Bregma AP: 1.5, L: 2, P 1 mm. A través de ese trépano se insertó 1 mm de profundidad en la corteza cerebral un macro electrodo de tungsteno recubierto con teflón, de 100 mm de diámetro (impedancia <0.5 MW).
La actividad EcoG se registró entre el macro electrodo y un electrodo de referencia colocado en la musculatura de la cabeza. Esta señal se filtró entre 0.3 y 100 Hz y se amplifico en un preamplificador P15 (Grass) y se digitalizó a una frecuencia de muestreo de 500 Hz mediante una tarjeta de adquisición 1401 de Cambridge Electronic Design (CED).
Mediante el programa Spike 2 (CED) se controlaron los parámetros de adquisición y análisis del EcoG. El análisis consistió en el cálculo del espectro de potencia de la actividad cerebral y la detección de los eventos epileptiformes mediante la colocación de un umbral que detectaba estos eventos en cada registro.
Después de finalizar el experimento se utilizó como método de eutanasia un flujo de oxígeno con Isofluorano al 2.5%, y posteriormente se administró una dosis letal de Pentobarbital (50 mg/Kg).
En el caso del análisis comparativo de dos grupos se aplicó un test T-Student, media, desviación estándar, para buscar diferencias significativas, considerando significativa una p< 0.05.
Existen o no, eventos relacionados con la actividad epiléptica en ratones transgénicos APP/PS1 , a diferentes edades (3, 6 y 18 meses) cuando ya han desarrollado la enfermedad?
Para analizar la señal de EcoG se tomaron registros de la actividad cerebral en la corteza somestésica durante 5-10-30 minutos y se determinó la presencia de actividad epileptiforme. Se consideró los siguientes patrones de actividad epileptiforme adaptados según los criterios de Clement C (53).
Spike: ondas de 20-70 ms de duración con polaridad positiva o negativa y
con amplitudes que exceden dos veces la amplitud media del EEG.
Sharp wave: onda con una duración de 70- 200 ms y amplitud variable.
Spike y complejo de onda (evento epiléptico): spike seguido de ondas
lenta de duración mayor de 200 ms.
Polispike: dos o más spikes consecutivas.
Polispike y onda lenta: polispike seguido de onda lenta.
Crisis electroencefalográfica: un claro cambio del patrón de trazado con la
aparición de descargas de spike repetidos o spike y onda lenta con una
alta amplitud y una duración de > 5 s.
RESULTADOS
Se estudió la actividad EcoG en la corteza somestésica para determinar la presencia de actividad epileptiforme en animales control y en animales transgénicos AAP/PS1 de acuerdo con los patrones descritos en la sección Materiales y Métodos (Fig. 6A). En animales controles se observaron de forma esporádica la presencia de “spikes” o “polispkes” que pueden deberse a la lesión provocada por la inserción del electrodo en la corteza cerebral. Los animales APP/PS1 también mostraron este tipo de actividad pero en un número mayor de animales que en los controles. Además, también presentaron otros patrones de actividad epileptiforme que no se observaron en los animales control como “sharp-waves” o descargas de polispikes de hasta 3 segundos de duración (Fig. 6B). Aunque los ratones APP/PS1 mostraron una actividad electrográfica de forma espontánea como spikes y polispikes, no presentaron una actividad epileptiforme como complejos de polispikes y ondas lentas o crisis electroencefalográficas que indicaran que estos animales tenían ataques epilépticos. La frecuencia de aparición de estos eventos fue muy variable en cada animal.
¿está la actividad epiléptica relacionada con la disminución de la actividad colinérgica en la corteza cerebral?
La presencia de esta actividad de tipo epileptiforme en los animales transgénicos puede deberse a una disminución de la actividad colinérgica en estos animales. Para determinar su respuesta a la acetilcolina, se registró el EcoG durante 15 minutos y luego se aplicó fisiostigimina intraperitonealmente (0.15 mg/Kg). La fisiostigmina es un bloqueante de la acetilcolinesterasa que provoca un aumento de los niveles de Ach en aquellos sitios donde se libera el neurotransmisor. En los animales controles, la aplicación de fisiostigmina provocó una disminución de la banda de frecuencias delta (0.5-4 Hz) del EcoG que se revirtió parcialmente a los 30 minutos después de la inyección (Fig. 7). Esta disminución de la banda de frecuencias delta se acompañó con una disminución de la banda de frecuencias theta (4-8 Hz) y un aumento estadísticamente significativo de las frecuencias dentro de la banda alfa (8-12 Hz). La potencia de las frecuencias más rápidas (>12 Hz) en el EcoG fue depreciable en estos animales anestesiados por lo que no fueron cuantificadas. En cambio, los animales transgénicos APP/PS1 no mostraron cambios en la banda de frecuencias delta o theta del EcoG tras la inyección de fisiostigmina y el aumento de la banda alfa fue menor que en los animales control (Fig.7). Por tanto, los datos indican que la actividad colinérgica está disminuida en los ratones APP/PS1.
Esta disminución de la actividad colinérgica podría ocasionar un aumento de la excitabilidad cortical y la aparición de una actividad epileptiforme. Por este motivo, se determinó la frecuencia de la actividad epileptiforme en animales control y en animales APP/PS1 tras la inyección intraperitoneal de fisostigmina. La inyección de fisostigmina provocó un aumento de la activación cortical en los ratones control, como se indicó anteriormente mediante el estudio del EcoG, y un aumento de la frecuencia de aparición de “spikes” (Fig. 8). En los animales transgénicos, el aumento de la activación colinérgica no produjo una disminución de la actividad epileptiforme sino que se produjo un aumento de la frecuencia de spikes y polispikes, pero no se produjeron actividades complejas ni crisis epilépticas de más de 5 s de duración, indicando que la fisostigmina aumentó la excitabilidad cortical tanto en ratones control como en los transgénicos pero no disminuyeron las actividades epileptogénica en los ratones transgénicos, como habíamos postulado
¿la presencia de placas de b-amiloide se correlaciona con la actividad epileptiforme en estos animales transgénicos?
Los anteriores resultados indican que el nivel de Ach no es fundamental en la generación de la actividad epileptiforme encontrada en los animales transgénicos APP/PS1. Teniendo en cuenta que estos animales presentan placas de amiloide a edades muy tempranas (> 3 meses), se cuantificó el número de placas de un diámetro mayor de 20 mm en la corteza somestésica y la frecuencia de actividad epileptiforme en esos mismos ratones. La figura 9 muestra que existe una relación lineal entre el número de placas y la frecuencia por minuto de actividad epileptiforme, sugiriendo que esta actividad puede deberse a la lesión provocada en la corteza cerebral por las placas de amiloide.
