GYGUHI

1. PRUEBA DE
AGLUTINACIÓN :
FUNDAMENTOS Y
CONCEPTOS

2. Introducción
◦ Las técnicas de aglutinación, al igual que otras técnicas inmunológicas, son útiles para la detección de
antígenos o de anticuerpos. Se fundamentan en inducir una agrupación macroscópicamente visible de
partículas, causada por interacciones antígeno-anticuerpo, que forman puentes entre ellas. Usualmente, el
antígeno se encuentra sobre las partículas y los anticuerpos forman los puentes. Pero también pueden
utilizarse diseños diferentes, en donde los anticuerpos de encuentran unidos a la superficie de las partículas, y
el antígeno forma los puentes.
Antígeno es una sustancia de alto peso molecular,
con cierta rigidez estructural y que tiene la particularidad
de ser parcialmente “metabolizado” por células
especializadas llamadas macrófagos, por lo tanto es
capaz de generar una respuesta inmune en un organismo
que la detecte como un agente extraño.
Un anticuerpo es una glicoproteína, producida por
linfocitos B activados, llamados células plasmáticas, como
respuesta a la presencia de un antígeno en el organismo,
a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por líneas
celulares in vitro, como es el caso de la producción de
anticuerpos monoclonales

3. ◦ . Dichos anticuerpos llamados también inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM,
IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre sí por sus características físicas, químicas y biológicas.

6. ◦ Las reacciones de precipitación son medibles
en cantidad y son fáciles de ejecutar. Las
técnicas de aglutinación son sólo
semicuantitativas y algo más difíciles. La
aglutinación de los antígenos nativos insolubles
o de las partículas recubiertas por el antígeno
puede evaluarse a simple vista con o sin la
ayuda del microscopio. Entre las ventajas de las
reacciones de aglutinación están su alto grado
de sensibilidad y la enorme variedad de
substancias identificables a través del uso de
partículas que están recubiertas por antígeno o
por anticuerpo.
En una aglutinación, los anticuerpos pueden estar dirigidos contra
componentes
propios de las partículas, por ejemplo de eritrocitos, bacterias,
otras células, etc., y en este
caso clasificamos a la técnica como una aglutinación directa o
activa
Un ejemplo de
aglutinación activa es la tipificación de los grupos
sanguíneos, de enorme trascendencia médica.

7. ◦ Alternativamente, los anticuerpos pueden
estar dirigidos contra un antígeno que se ha
unido artificialmente a una partícula, la cual
actúa como un medio de soporte pasivo, en
cuyo caso clasificamos a la técnica como una
aglutinación indirecta o pasiva

8. ◦ Según Coombs existen 3 requerimientos principales en las pruebas
de aglutinación:
1. Disponibilidad de una suspensión estable de células o de partículas.
2. Presencia de uno o más antígenos cercanos a la superficie.
3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos“ o no
aglutinables no son localizables sin modificación (reacciones
antiglobulina).

9. Prueba de Coombs
◦ La prueba de Coombs (también conocida como prueba
de antiglobulina) es un examen de sangre que se usa en
inmunología y hematología. Este análisis puede detectar
la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con
antígenos en la superficie de los glóbulos rojos. Hay dos
tipos distintos de la prueba de Coombs: el directo y el
indirecto. La prueba de Coombs directa detecta
anticuerpos ya unidos a la superficie de los glóbulos
rojos, y la prueba de Coombs indirecta detecta
anticuerpos libres que pueden reaccionar in vitro con
glóbulos rojos que tienen antígenos específicos.
https://www.youtube.com/watch?v=SaJU56MsW38

10. Clasificación de las reacciones de aglutinación

11. ◦ Prueba de Coombs directa
◦ Esta prueba se usa para determinar si hay complemento o anticuerpos ya fijados a los eritrocitos tomados
directamente del paciente. Estas células, alcanzadas de una venopunción, se lavan y se agrega el reactivo de
Coombs. Los anticuerpos del reactivo se unen a IgG, IgM, o complemento que está unido a la superficie de
los glóbulos rojos. Estos se aglutinan, produciendo grupos de células que indican un resultado positivo.
Trastornos asociados con un resultado positivo
Anemias hemolíticas inducidas por fármacos34
Anemias hemolíticas inmunitarias
Reacciones a transfusión
Enfermedad hemolítica del recién nacido
Trastornos linfoproliferativos, como leucemia linfocítica crónica34
Mononucleosis infecciosa
Algunas enfermedades pueden causar hemólisis no inmunitaria, como la esferocitosis hereditaria
y la talasemia. Estos trastornos no son asociados con un resultado positivo en la prueba de
Coombs porque no son causados por anticuerpos hemolíticos.

13. ◦ Prueba de Coombs indirecta
◦ Se detectan anticuerpos específicos de ciertos antígenos que no necesariamente están presentados en los
glóbulos rojos del paciente, pero puede estar en glóbulos rojos de otras personas. Si se mezcla suero tomado
de un paciente que contiene estos anticuerpos con glóbulos rojos que sí muestran estos antígenos específicos,
los glóbulos rojos se van a cubrir con anticuerpo.
◦ Una vez cubiertas, las células se van a aglutinar después de una exposición al reactivo de Coombs. En el
diagnóstico de eritroblastosis fetal, el suero tomado de la madre Rh- no reacciona con su propia sangre, sino
con la de su feto Rh+. El suero de la madre, que contiene anticuerpos específicos del factor Rh, se mezcla
con glóbulos rojos Rh+. Los anticuerpos del suero se unen a las células. Luego, se agregan anticuerpos
antihumanos para aglutinar los glóbulos rojos. Se puede diluir el suero y hacer la prueba repetidas veces, para
cuantificar los anticuerpos en el suero

15. Aglutinación directa
◦ Un antígeno celular o de partículas insolubles es aglutinado directamente por el anticuerpo. Un ejemplo de esto es la
aglutinación de los eritrocitos del grupo A por antisueros antiA, la aglutinación de los eritrocitos RH positivos por
el antisuero anti-D o la aglutinación del antígeno brucelar por anticuerpos anti-Brucella.
◦ Gran cantidad de partículas como pueden ser eritrocitos, bacterias, hongos y virus pueden ser aglutinados por
anticuerpos séricos, algunas veces de manera inespecífica y otras muy específica, siendo ésta última, respuesta a una
previa inmunización del organismo productor de los anticuerpos séricos. Las pruebas para identificar anticuerpos
específicos son llevadas a cabo titulando seriadamente antisueros en diluciones al doble en presencia de una
cantidad constante de antígeno
Mecanismo
Ambas pruebas de Coombs emplean un antisuero llamado reactivo de
Coombs, que contiene anticuerpos de animales inmunizados dirigidos contra
IgG, IgM, y/o complemento humano.
1 Estos anticuerpos se unen a los anticuerpos de los antígenos que están en la
superficie de los glóbulos rojos, causando aglutinación de las células.
2 Esta aglutinación observada corresponde a un resultado positivo, y la
ausencia de aglutinación es un resultado negativo.

16. Aglutinación indirecta
◦ Se refiere a la aglutinación de las células recubiertas de antígeno o a las partículas inertes que son portadoras
pasivas de antígenos solubles. Se tienen ejemplos de lo anterior en la utilización de partículas de gelatina en la
búsqueda de anticuerpos contra Treponema pallidum por aglutinación pasiva (TPPA), la fijación del látex para
VDRL en la sífilis y en la utilización de eritrocitos en la prueba de hemaglutinación indirecta (HAI) en la
búsqueda de anticuerpos contra Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas. De manera
alterna, el antígeno puede ser localizado recubriendo partículas de látex o eritrocitos con anticuerpo
purificado y practicando la llamada aglutinación inversa.

17. ◦ https://www.youtube.com/watch?v=D-grgg-g4u8 (aglutinación)

18. Floculación
◦ La floculación es un proceso de agregación de partículas en dos
pasos en el que un gran número de partículas pequeñas forman
una pequeña cantidad de grandes flóculos.
◦ Paso 1: coagulación
◦ Las partículas pequeñas suelen tener cargas superficiales
negativas que dificultan la agregación y la estabilización (1a). Los
productos químicos coagulantes pueden adsorberse en las
partículas y equilibrar las cargas. La introducción de cargas
opuestas permite que las partículas que se unen formen flóculos
submicrónicos estables y en suspensión (1b). Se requiere una
mezcla rápida para la correcta dispersión de los productos
químicos coagulantes, para promover las colisiones de las
partículas y la formación de flóculos submicrónicos (1c).

19. ◦ Paso 2: floculación
◦ Para la floculación, se requiere un mezclado suave y el uso de un
floculante polimérico de alto peso molecular. El floculante se
adsorbe en los flóculos submicrónicos y facilita la reducción de
los espacios entre los flóculos (2a). El acercamiento de las
partículas crea el rango efectivo de las fuerzas de atracción de
Van Der Waals para disminuir la barrera energética de la
floculación y la formación de flóculos sueltos.
◦ La agregación, la unión y el fortalecimiento de los flóculos se
desarrollan hasta que se forman macroflóculos visiblemente en
suspensión (2b). Con el peso, tamaño y resistencia adecuados, se
produce la sedimentación. Los macroflóculos son muy sensibles
al mezclado y, una vez divididos por una fuerte cizalladura,
resulta difícil o imposible que vuelvan a formarse.

22. ◦ Aglutinación
◦ - Técnica semicuantitativa: se toma una gota de sangre sobre una placa de vidrio, se le pone un antisuero o
anticuerpo monoclonal contra A o contra B y se dice si el paciente es A o B dependiendo de la aparición
degrumos (aglutinación). Se pueden hacer diluciones de suero y hacerla cuantitativa, pero para los casos de
hemoclasificación no es necesario hacer diluciones seriadas (el paciente puede ser A positivo, B positivo u O
si no hace aglutinación

23. ◦ ).- Requerimientos:
◦ • Células o partículas: se trabaja con glóbulos rojos de carnero, humanos RH - (estos se pueden lisar o crenar
a pesar de que se tienen en una solución buffer) o con partículas estables como el látex (han permitido que
las reacciones sean exactas y que no hayan falsos positivos o falsos negativos).
◦ • Deben haber 2 o más antígenos cercanos.
◦ • Anticuerpos aglutinantes: IgG e IgM (no se pueden pedir aglutininas tipoA), las únicas isohematoaglutininas
son la IgM (son los anticuerpos contra los grupos sanguíneos diferentes).-
◦ El anticuerpo puede unirse a la vez a dos antígenos, así mismo cada antígeno puede unirse
a varios anticuerpos y formar un entramado de complejos Ag - Ac.-

24. ◦ Usos:
◦ seroclasificacíon, técnicas en látex o detección de partículas virales.
◦ - Ejemplo: se pide una proteína C reactiva en el laboratorio para evaluar si el paciente tiene un estado
inflamatorio agudo de índole infecciosa o por un trauma, su validez es de 24 a 48horas.
◦ • Se utilizan Ag contra PCR, es negativa cuando no hay aglutinación o positiva si hay aglutinación.
◦ Pero no solo se informa el resultado cuantitativo (positivo o negativo), también se puede partir del valor de
cortenormal que es <6 mg/dL y hacer diluciones seriadas de la muestra para informar hasta
donde hay positividad (1/1, 1/2, 1/4 o 1/8, el último valor informa un resultado negativo).
◦ • Las proteínas que inducen la producción de proteínas de fase aguda en el hígado son la IL-1, IL-6 y TNF-
alfa.

25. ◦ Precipitación (floculación)-
◦ El antígeno se encuentra disuelto en el medio y al unirse a los antígenos se forman macrocomplejos
moleculares, formando una red tridimensional que debido a su tamaño precipita. Por medio de la
precipitación se determina la reacción de anticuerpos contra cardiolipinas.-
◦ La sífilis es una enfermedad producida por una bacteria llamada treponema pallidum, no ha todos los
pacientes se les puede hacer pruebas de floruorecencia por su elevado costo, por eso se realizan
pruebas VDRL con anticuerpos contra cardiolipinas que tienen una sensibilidad y especificidad del 75%.
◦ El VDRL es la prueba estándar para el diagnóstico de sífilis, pero hay que tener cuidado porque el 25% de
los resultados positivos son falsos(este porcentaje se debe a que las cardiolipinas son compuestos lipídicos
que están tanto en la pared celular de algunos microorganismos, como en la pared de nuestros glóbulos rojos)

26. En esta prueba se forman flóculos, no hay aglutinación, sino que las células se
precipitan como grupos de
algodón sobre la muestra.
- Pacientes con enfermedades tropicales (malaria, dengue, etc.), mujer en
embarazo (pueden tener síndrome
anti fosforílico, se generan Ac contra los fosfolípidos de las membrana), pacientes
con enfermedades
autoinmunes e incluso una simple gripa pueden causar resultados falsos.
Por medio de la historia clínica se
puede corroborar si realmente el resultado positivo es el
reflejo de una infección.
Si la muestra está hemolisada o si es
de un paciente que ha desayunado grasas va a dar
positiva porque se van a detectar los lípidos.

27. - Se utiliza como una prueba de screening para determinar
positividad o negatividad, cuando no hay un buen
respaldo de historia clínica se hacen otras pruebas para
confirmar el resultado.
- Se miden inmunoglobulinas principalmente del tipo M, que
con el tratamiento se deben negativizar.
Si a pesar del
tratamiento no se negativizan las IgM hubo una mala
formulación del tratamiento y la enfermedad puede
deberse a un proceso autoimune.

28. Referencias
◦ https://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043p.pdf
◦ https://core.ac.uk/download/pdf/67713088.pdf
◦ http://www.alergomed.org/uploads/1/0/0/2/10021998/lectura_prctica_-_inmunoensayos_2.pdf
◦ https://curiosoando.com/que-tipos-de-anticuerpos-hay-en-nuestro-sistema-inmune
◦ http://exa.unne.edu.ar/bioquimica/inmunoclinica/documentos/Introduccion_TPN6.pdf